[发明专利]一种基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法

说明书

本发明公开了一种食品中志贺氏菌快速检测的方法，属于微生物快速检测领域。本检测方法包括以下步骤：对油溶性上转换荧光材料进行氨基修饰、羧基修饰，将志贺氏菌适配体和互补链分别修饰在金纳米和上转换荧光材料表面，利用适配体和互补链之间碱基互补配对作用，构建上转换‑金纳米荧光检测体系；利用上转换材料和金纳米之间的荧光共振能量转移作用探究志贺氏菌菌液浓度和荧光信号强度之间的关系。本发明建立的检测体系具有较宽的检测范围和较低的检测限，其中线性检测范围为1.2×10²CFU/mL‑1.2×10⁸CFU/mL，检测限为30CFU/mL，灵敏度较高，并且能够特异性地检测食品中的志贺氏菌。

技术领域

本发明属于微生物快速检测领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的致病菌快速检测技术。

背景技术

志贺氏菌也称作痢疾杆菌，属于革兰氏阴性短小菌，在自然界存在广泛，动物和人类的胃肠道中均可发现，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。细菌性痢疾是最常见的肠道传染病，夏秋两季患者最多。传染源主要为病人和带菌者，通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。本病主要临床表现为全身中毒症状、腹痛、腹泻、痢疾后重及黏液脓血便，细菌性痢疾是重要的肠道传染病，在我国细菌感染病中居首位。

目前常见的细胞培养技术、分子生物学法由于操作繁琐，费时耗力，不能满足现场快速检测的需要；而免疫学检测法试剂保藏困难，且酶活性易受环境影响，准确性差，不能满足当今经济全球化情况下食品快速流通的需要。目前，基于上转换荧光材料检测致病菌是一种新兴的检测方法，利用上转换荧光材料建立食品流通中的快速检测方法，为食品中志贺氏菌的快速检测提供技术支持，对及时有效控制志贺氏菌传播、预防食物中毒、减少食源性疾病的发生有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是基于上转换材料和金纳米的荧光共振能量转移效应，对志贺氏菌进行快速检测，以解决上述技术存在的问题。通过构建上转换-金纳米检测体系，实现快速检测食品中志贺氏菌，且该方法在检测时间上优于传统的平板计数法。

为了实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，包括以下步骤：

步骤1，制备得到上转换荧光纳米材料：将六水氯化钇、六水氯化钆、六水氯化镱以及六水氯化铒四种材料和乙醇、油酸、1-十八烯混合放置于三口烧瓶中，全程在氮气的保护下加热升温，随后冷却至室温；将氟化铵、氢氧化钠分散于甲醇溶液中，并缓慢加入冷却体系中，分两阶段水浴加热。在氮气的保护下，再次对反应体系进行加热，冷却至室温后用乙醇和环己烷进行多次离心清洗，真空干燥后得到油相的上转换纳米材料。

步骤2，水溶性修饰上转换荧光纳米材料：将步骤1得到的油相的上转换荧光纳米材料溶于三氯甲烷和乙醇的混合溶液中，并和阿仑膦酸在酸性的环境下进行搅拌混合。反应结束后用纯水和乙醇对材料进行多次清洗，最终分散在纯水中。

步骤3，羧基修饰上转换荧光纳米材料：将步骤2得到的水溶性的上转换荧光纳米材料溶于甲苯和丁二酸酐的混合溶液中，全程在氮气保护下，在水浴锅中加热，反应结束后，利用甲苯、纯水和乙腈多次清洗，真空干燥得到羧基修饰的上转换荧光纳米材料。

步骤4，羧基修饰的上转换荧光纳米材料修饰互补链：将步骤3得到的羧基修饰的上转换荧光纳米材料分散至缓冲溶液中，加入戊二醛振荡反应，反应结束用缓冲溶液多次清洗；用缓冲溶液进行复溶，加入志贺氏菌互补链振荡反应，反应结束用缓冲溶液多次清洗，最后用缓冲溶液复溶后备用。

步骤5，合成金纳米材料：将氯金酸分散在超纯水中，加热至沸腾后，保持沸腾状态，加入分散在超纯水中柠檬酸三钠，待重新沸腾后保持沸腾状态，反应结束后关闭热源，待溶液冷却后备用。