[发明专利]一种基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法

权利要求书

1.一种基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1，制备得到油溶性上转换荧光纳米颗粒：将六水氯化钇、六水氯化钆、六水氯化镱以及六水氯化铒四种材料和乙醇、油酸、1-十八烯混合放置于三口烧瓶中，全程在氮气的保护下加热升温，随后冷却至室温；将氟化铵、氢氧化钠分散于甲醇溶液中，并缓慢加入冷却体系中，分两阶段水浴加热。在氮气的保护下，再次对反应体系进行加热，反应结束后冷却至室温，用乙醇和环己烷进行多次离心清洗，真空干燥后得到油相的上转换纳米材料。

步骤2，制备阿仑磷酸修饰上转换荧光纳米颗粒：将步骤1得到的油相上转换荧光纳米材料溶于三氯甲烷和、乙醇和阿仑磷酸的混合溶液中，超声后置于离心管中，通过pH试纸调节pH值，使整个体系在酸性的环境下进行搅拌混合。反应结束后用纯水和乙醇对材料进行多次清洗，最终分散在纯水中，获得了水溶性上转换荧光材料。

步骤3，制备羧基修饰上转换荧光纳米颗粒：将步骤2得到的水溶性上转换荧光纳米材料溶于甲苯后超声，然后加入丁二酸酐，全程在氮气保护下，在水浴锅中加热升温，并保持一段时间，反应结束后，利用甲苯、纯水和乙腈多次清洗，真空干燥后得到羧基修饰的上转换荧光纳米材料。

步骤4，羧基修饰的上转换荧光纳米材料修饰互补链：将步骤3制备的羧基修饰上转换荧光纳米颗粒分散在吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中进行超声处理。将碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液加入到上述溶液中进行搅拌反应，反应结束后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)多次清洗，并重新分散在PBS溶液中。再将志贺氏菌的适配体互补链添加到溶液中搅拌反应，最后用PBS缓冲液多次清洗得到互补链修饰的上转换荧光纳米材料。

步骤5，合成金纳米材料：将氯金酸溶液加热至沸腾后，加入柠檬酸三钠溶液，待重新沸腾后反应一段时间，反应结束后关闭热源，待溶液冷却后备用。

步骤6，构建上转换-金纳米检测体系：将金纳米与志贺氏菌适配体进行连接，后添加修饰志贺氏菌互补链的上转换荧光纳米材料，最后加入志贺氏菌进行荧光信号强度测定，以志贺氏菌浓度为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，构建标准曲线。

步骤7，验证检测体系特异性：选择不同种类的标准菌株重复本发明的检测过程，记录输出的荧光信号强度。

2.根据权利要求1所述的基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，其特征在于，步骤1中，六水氯化钇、六水氯化钆、六水氯化镱以及六水氯化铒质量比为：0.3492g∶0.2676g∶0.1860g∶0.0180g，乙醇∶油酸∶十八烯＝1mL∶3mL∶7mL；第一次加热温度为：150-170℃，加热时间为30min；氟化铵和氢氧化钠的质量比为：0.1472g∶0.1g，甲醇为10mL；两阶段水浴条件为：50℃搅拌水浴40min，70℃水浴30min；第二次升温温度为290-310℃，加热时间为1h。

3.根据权利要求1所述的基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，其特征在于，步骤2中，阿仑膦酸质量为50mg，上转换材料∶三氯甲烷∶乙醇＝200mg∶10mL∶4mL；酸性条件为pH＝2-5，搅拌时间为30min。

4.根据权利要求1所述的基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，其特征在于，步骤3中，上转换材料∶甲苯∶丁二酸酐＝40mg∶15mL∶5mL；加热温度为80℃，加热时间为12h。

5.根据权利要求1所述的基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，其特征在于，步骤4中，上转换材料∶MES缓冲溶液＝5mg∶2.5mL，EDC∶NHS∶纯水＝160mg∶160mg∶80mL，PBS缓冲液为2.5mL，互补链为500μL(1μmol/mL)。

6.根据权利要求1所述的基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，其特征在于，步骤5中，氯金酸溶液中氯金酸∶超纯水＝16.98mL∶50mL，柠檬酸三钠∶超纯水＝0.05g∶4.95mL，两次沸腾状态均保持10min。

7.根据权利要求1所述的基于上转换-金纳米荧光共振能量转移的志贺氏菌快速检测方法，其特征在于，步骤6中，适配体的浓度为1μmol/mL，上转换材料浓度为4mg/mL；上转换材料∶金纳米∶志贺氏菌＝140μL∶140μL∶20μL。