[发明专利]一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽免疫小鼠后产生的免疫应答效应

权利要求书

1.一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽免疫小鼠后产生的免疫应答效应，其特征在于，其研究包括如下步骤：

S1、多表位疫苗的设计：

筛选出T细胞表位肽和B细胞表位肽的N端耦联KLH载体，构建单独T细胞或B细胞表位疫苗rEg.P29_T和rEg.P29_B，将T细胞表位肽和B细胞表位肽使用通用连接子GSGSGS连接后在B细胞表位肽的N端耦联KLH载体，构建T细胞和B细胞表位联合疫苗rEg.P29_T+B；

S2、实验动物的免疫：

分别使用20μg/ml rEg.P29_T、rEg.P29_B、rEg.P29_T+B以及rEg.P29加40μg/ml CpG佐剂免疫6-8周龄的C57BL/6小鼠，100μl/只小鼠，剩余部分用PBS补足，腹部皮下免疫；

S3、肽疫苗免疫小鼠血清特异性抗体检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周分离免疫组和对照组血清，使用rEg.P29或rEg.P29_B包被ELISA板，免疫小鼠血清作为一抗，用ELISA方法检测免疫小鼠血清中特异性抗体水平；

S4、肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG抗体滴度检测：

末次免疫后2周的免疫血清按照不同比例稀释1:100，1:400，1:1600，1:6400以及1:25600，然后使用步骤S3的方法检测小鼠血清中抗rEg.P29或rEg.P29_B特异性IgG抗体滴度；

S5、ELISPOT检测rEg.P29或rEg.P29_B特异性IgM和IgG斑点形成细胞：

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，将其接种在rEg.P29或rEg.P29_B包被的ELISPOT板中，37℃，5％CO₂中培养24h后取出，使用ELISPOT法检测rEg.P29或rEg.P29_B特异性IgM和IgG斑点形成细胞；

S6、肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG1/IgG2a抗体比值检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周分离免疫组和对照组血清，使用rEg.P29或rEg.P29_B包被ELISA板，免疫小鼠血清作为一抗，用步骤S3所示的方法检测免疫小鼠血清中特异性IgG1/IgG2a抗体比值；

S7、肽疫苗免疫小鼠脾脏淋巴细胞中的特异性细胞因子检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照实施例5所示方法分离各组小鼠脾脏淋巴细胞，体外刺激后，37℃，5％CO₂培养72h，ELISA法检测培养上清中的细胞因子；

S8、ELISPOT检测抗原特异性IFN-γ和IL-4斑点形成细胞数目：

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，体外刺激后将其接种提前包被的ELISPOT板中，37℃，5％CO₂中培养24h后取出，使用如步骤S5所示方法检测抗原特异性IFN-γ和IL-4斑点形成细胞；

S9、流式细胞术分析免疫后脾细胞抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞分泌的IFN-γ和IL-4的比例：

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，体外刺激后流式细胞术检测抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞分泌的IFN-γ和IL-4的比例；

S10、记忆B细胞、浆细胞和浆母细胞表型检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照实施例5所示方法分离各组小鼠脾脏淋巴细胞，采用步骤S9所示方法检测记忆B细胞、浆细胞和浆母细胞表型；

S11、记忆性CD4⁺和CD8⁺T细胞表型检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照步骤S5所示方法分离各组小鼠脾脏淋巴细胞，采用步骤S9所示方法检测记忆性CD4⁺和CD8⁺T细胞表型。