[发明专利]一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用

说明书

本发明公开了一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，包括以下步骤：从冬油菜六叶期开始采集根系；冬油菜根系脂质提取；采用液相色谱‑质谱分析鉴定目标脂质分子结构，通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析；组间差异脂质筛选；确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。本发明方法是在冬油菜越冬期，采集自然降温状态下不同抗寒级别冬油菜品种(系)根部组织；采用拟靶向脂质组学获得冬油菜根系脂质定性定量结果，对不同品种(系)的冬油菜根部的共有差异脂质分子进行方差分析，确定抗寒有关的标志物，可以用于冬油菜抗寒性评价、抗寒品种(系)选育等方面。

技术领域

本发明属于冬油菜抗寒性鉴别技术领域，涉及一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用，更具体的说是涉及通过拟靶向脂质组学的分析方法获得冬油菜根系脂质定性定量结果，对不同品种(系)的冬油菜根部的共有差异脂质分子进行方差分析，确定抗寒有关的标志物。

背景技术

北方旱寒区冬季漫长，极端低温达到-32℃。超强抗寒白菜型冬油菜是一种能在北方旱寒区稳定越冬，返青率高的越冬油料作物。越冬期冬油菜地上部分枯萎，只有根系保持活力。根系抗寒性是决定冬油菜在该区能否安全越冬的关键因子。

膜的流动性是维持正常膜功能的基础，脂类是细胞膜的重要结构组分。脂质在植物应对寒冷胁迫中发挥重要作用。脂类物质的变化是生物体响应外界因素变化的特征表现。脂质组学通过研究脂质提取物，可获得脂质组的信息，了解在特定生理状态下脂质的整体变化。

目前，油菜抗寒性鉴定主要用田间鉴定和实验室鉴定等方法。田间主要统计越冬率，实验室主要测定与抗寒相关的生理指标，很少有通过脂质分析对不同抗寒品种(系)进行分析鉴别。

因此研发一种采用拟靶向脂质组学分析法明确与冬油菜抗寒有关的特征标志代谢物，在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，包括以下步骤：

1)从冬油菜六叶期开始采集根系，采样间隔期20-30天。每品种(系)采集3株根系洗去泥土，去离子水冲洗后晾干水分，切碎后混合获得1个混样，每品种(系)每次采集6个混样，-80℃保存备用；

2)冬油菜根系脂质提取，每品种(系)6次生物学重复；

3)采用液相色谱-质谱分析鉴定固醇脂类、脂肪酰类、甘油磷脂类、甘油酯类和鞘脂类目标脂质分子结构，通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析；

4)组间差异脂质筛选；

5)确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。

进一步，上述冬油菜根系脂质提取的方法包括以下步骤：

每个生物学重复取60mg混样加入300μL甲醇和水的混合物，甲醇和水的体积比为1:1，-20℃的条件下静置2min；用频率为60Hz研磨机研磨2min；加入300μL氯仿，涡旋30s后25℃超声提取10min，超声功率为300W；-20℃静置20min，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取200μL下层氯仿层装入LC-MS进样瓶中；

对残渣二次提取后取300μL下层氯仿层，放入所述LC-MS进样瓶中挥干；