[发明专利]一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用

权利要求书

1.一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于,包括以下步骤：

1)从冬油菜六叶期开始采集根系，采样间隔期20-30天。每品种(系)采集3株根系洗去泥土，去离子水冲洗后晾干水分，切碎后混合获得1个混样，每品种(系)每次采集6个混样，-80℃保存备用；

2)冬油菜根系脂质提取，每品种(系)6次生物学重复；

3)采用液相色谱-质谱分析鉴定固醇脂类、脂肪酰类、甘油磷脂类、甘油酯类和鞘脂类目标脂质分子结构，通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析；

4)组间差异脂质筛选；

5)确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。

2.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，所述冬油菜根系脂质提取的方法包括以下步骤：

每个生物学重复取60mg混样加入300μL甲醇和水的混合物，甲醇和水的体积比为1:1，-20℃的条件下静置2min；用频率为60Hz研磨机研磨2min；加入300μL氯仿，涡旋30s后25℃超声提取10min，超声功率为300W；-20℃静置20min，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取200μL下层氯仿层装入LC-MS进样瓶中；

对残渣二次提取后取300μL下层氯仿层，放入所述LC-MS进样瓶中挥干；

用200μL异丙醇和甲醇的混合物，异丙醇和甲醇的体积比1:1，复溶LC-MS瓶中的脂质残渣，然后加入混合同位素内标20μL，将溶液转移至1.5mL的离心管中，再在-20℃的条件下静置2h，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取150μL上清液装入带内衬管的LC-MS进样瓶中，得到冬油菜根系脂质提取物。

3.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，液相色谱测定的条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，100mm×2.1mm,1.8um，流动相A：乙腈:水＝(60:40，V/V)，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；流动相B：乙腈:异丙醇＝(10:90，V/V)，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；柱温55℃，流速：0.35mL/min；

进样量：5μL；梯度洗脱条件如下：0～5min：55％B；5～10min：55％B～60％B；10～13min：60％B～70％B；13～15min：70％B～90％B；15～16min：90％B～100％B；16～18min：100％B。

4.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，所述质谱分析条件如下：气帘气35psi；离子喷雾电压-4500/5500V；源温度350℃；雾化气:40psi；辅助加热气:45psi，采用schedule-MRM模式对脂类物质进行高通量分析。

5.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，所述组间差异脂质筛选方法为：采用正交偏最小二乘方-判别分析中，变量权重值第一主成分的VIP值1和T检验的p-value值0.05作为筛选差异脂质的标准。

6.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，所述抗寒标志物的确定方法为：对不同品种(系)采样期共有差异脂质进行方差分析，确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。

7.一种权利要求1-6任一项所述的在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法在冬油菜抗寒性评价、抗寒品种或品系选育中的应用。