[发明专利]MDCK细胞成瘤性检测方法

说明书

本发明涉及MDCK细胞成瘤性检测方法。本发明提供了用于MDCK细胞成瘤性检测方法的引物组、包含该引物组的试剂盒以及使用所述引物组进行MDCK细胞成瘤性检测的方法。

技术领域

本发明涉及细胞成瘤性检测领域，具体涉及用于MDCK细胞成瘤性检测的引物组和包含其的试剂盒以及使用引物组的MDCK细胞成瘤性检测方法。

背景技术

在疫苗生产中，传统流感疫苗采用以鸡胚为基础的制造工艺生产，鸡胚需要SPF级别，产量有限，疫苗生产过程繁琐耗时，且有潜在的禽流感传播风险。1995年，世界卫生组织(WHO)建议开发替代流感病毒培养系统，特别是研究有前景的哺乳动物细胞培养系统，以此替代鸡胚流感疫苗。相比于鸡胚基质来源的流感疫苗生产工艺，选用细胞生产流感疫苗有其特有的优点。细胞及流感病毒培养是在封闭系统的生物反应器中进行，可以更快地启动和扩大疫苗生产，大大缩短周期。细胞培养还消除了接种者对鸡蛋过敏个体发生过敏反应的风险，降低了微生物或化学污染的风险。

MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney cells)是一种来源于考克斯班尼犬肾脏中肾小管的细胞系，由Madin和Darby于1958年在健康的成年雌性犬中分离出来并命名。由于MDCK细胞具有对流感病毒比较敏感、流感病毒感染效率高、抗原匹配度高、适应于无血清生长条件、增殖快、不易变异等优点，被公认为最适于生产流感病毒疫苗的细胞系之一。目前广泛应用于流感病毒的增殖、感染性滴度检测、流感病毒的分离培养及流感疫苗生产等研究。

保证生产用细胞基质的安全性是保证生物制品安全性的一个重要因素。然而，MDCK细胞本身是具有成瘤性的。成瘤性是指将完整的活力较高的MDCK细胞注射入免疫缺陷型裸鼠中具有形成结节的现象。MDCK细胞的成瘤性可能会引发安全性担忧，因此利用其生产的疫苗的安全性一直存在争议。Omeir等的研究显示，悬浮MDCK细胞以10个细胞/只小鼠的注射量即可能形成肿瘤(Omeir RL等，Heterogeneity of the tumorigenic phenotypeexpressed by Madin-Darby canine kidney cells.Comp Med.2011Jun；61(3):243-50.PMID:21819694；PMCID:PMC3123757)。因此，有必要对用于流感疫苗生产的MDCK细胞进行成瘤性检测。

目前，一般采用动物体内接种法来检测细胞成瘤性。可以根据细胞的特性及动物的敏感性选择动物种类，如我国及WHO建议采用裸鼠或经抗胸腺抗体处理过的NOD/SCID鼠，其它方式包括采用同系小鼠进行体内接种。体内接种的细胞数量也需要进行摸索，一般是100至10000个细胞。而且不同动物模型的敏感性会存在差异，测试时所需接种的细胞数量较大，检测时限较长，有时可能需要5个月左右甚至更长时间。

然而，动物体内接种法检测MDCK细胞要求实验场所和实验动物是SPF级别的，因而该方法所使用的裸鼠及场地均价格昂贵，成本较高。另外，由于该方法使用动物进行体内检测，相关动物实验涉及动物伦理问题，且时间跨度通常在4个月以上(例如，包括在裸鼠经接种后至少16周的观察期)，导致经济和时间成本的增加，并极大地延长了研发和生产进程。

软琼脂克隆法是除了动物体内接种法之外的另一种检测细胞成瘤性的方法。软琼脂克隆法又称非锚定依赖性生长实验(Anchorage-independent assay)，利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。细胞在软琼脂中形成克隆的能力反映了细胞肿瘤的恶性程度。WHO及FDA关于生产用动物细胞检定的相关法规中提出，体外软琼脂克隆法可以为细胞成瘤性评价提供更多信息，特别是对于传代水平较低时在动物体内不成瘤的细胞，软琼脂法可能更适用。