[发明专利]利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法和应用

说明书

本发明属于植物基因工程和生物技术领域，特别涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法和应用。该方法通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑甘蓝型油菜BnaA06G0083400WE基因，获得甘蓝型油菜矮化材料；所述甘蓝型油菜矮化材料的编码基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对甘蓝型油菜BnaA06G0083400WE基因进行基因编辑，得到矮化的甘蓝型油菜，为甘蓝型油菜育种提供宝贵的基因资源和种质资源；该方法特性强，容易获得，是实现目标性状改良，培育新材料的有效途径，可应用于油茶育种中。

技术领域

本发明属于植物基因工程和生物技术领域，涉及甘蓝型油菜BnaA06G0083400WE基因定点突变的方法和应用，特别涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法和应用。

背景技术

株高直接影响作物的抗倒性能和丰产潜力，成为现代作物育种和理想株型育种的重要指标之一。矮化育种是绿色革命的重要组成部分，其最早开始于Norman Borlaug于1950发起的小麦育种革命，而水稻半矮秆基因sd1和小麦Rht8的发现以及应用则是这场革命的里程碑此后，水稻、玉米和黄瓜等作物的矮化育种工作相继开展了起来。

目前我国油菜主产区90％以上油菜品种都是甘蓝型油菜，株高高于180cm的占36％以上，低于160cm的仅11％。株高过高易引起倒伏、不耐肥、不适宜机械化操作等生产问题，是制约油菜机械化生产的重要因素之一。在油菜倒伏后，油菜每角果粒数下降17.5％，种子产量降低16.2％，同时油菜机械化收获的难度和机损率增加，进而导致收获性减产。目前，多位研究者通过诱变、自发突变等途径获得一些油菜矮秆中间型材料，但由于植株过矮、冬前长势弱、矮秆植株自交不亲和以及病害严重等因素，至今仍未获得农艺性状优良的矮秆油菜在生产上应用。因此，培育矮秆或半矮秆油菜品种并对其遗传分析研究，对于提高油菜机械化收获具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法和应用，可为油菜育种，特别是甘蓝型油菜育种提供宝贵的基因资源和种质资源。

在进行本发明试验之前，发明人就进行了大量的研究和总结。

模拟病斑突变体是一类在没有明显的逆境、损伤或病原物侵害时，在叶片上能自发地形成类似病原物侵染后的程序性细胞死亡的突变体，这类突变体在植物中广泛存在，如：拟南芥、水稻、玉米、高粱、小麦、大麦和花生中等均有报道。这些突变体在发生程序性细胞死亡的同时表现出对许多病原物表现出局部和系统抗性。据报道，许多模拟病斑突变体典型的表型是矮化。如模拟病斑突变体ssi4表现为矮化和细胞自发死亡；chs3-2D的突变触发免疫激活，模拟病斑突变体chs3-2D导致极端矮化症和防御反应的激活；模拟病斑突变体bir1-1表现出极端矮化表型、自发细胞死亡和防御反应；钙调素结合转录激活子(CAMTA)3的T-DNA插入突变体在低温生长时表现出增强的抗病性和矮化症；另外，模拟病斑突变体bon1和snc4-1D、snc2-1D、mkk1 mkk2、bir1-1、ssi4、cpr22和slh1都表现不同程度的矮化表型。

酪氨酸降解途径首先在动物和细菌中被发现，该代谢途径通过五个步骤进行降解，最后一个步骤在延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解。已从拟南芥中鉴定出典型酪氨酸降解途径的基因和酶，并证明它们在体外具有各自的催化活性。发明人在拟南芥中筛选鉴定出一个在短日照条件下形成模拟病斑的突变体sscd1(short-day sensitive celldeath1)，该突变体在长日照条件下与野生型拟南芥没有明显的差异；但在短日照条件下，在没有受到病原物侵染的情况下，叶片局部产生类似坏死的病斑。通过图位克隆的方法，已分离鉴定出SSCD1基因，发现该基因编码FAH。