[发明专利]利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法和应用

权利要求书

1.一种利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法，其特征在于，通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑甘蓝型油菜BnaA06G0083400WE基因，获得甘蓝型油菜矮化材料；

所述甘蓝型油菜矮化材料的编码基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)甘蓝型油菜BnaA06G0083400WE基因CRISPR/Cas9表达载体的构建：

1)sgRNA靶位点的选择：

所述sgRNA靶位点是针对甘蓝型油菜westar中BnaA06G0083400WE基因不同拷贝的结构和同源关系，基于CRISPRdirect网站设计，核苷酸序列为：

SEQ ID NO.2：5’-agaggtcaaggccatccacaagg-3’；

2)引物设计和PCR扩增：

所述引物序列如下：

SEQ ID NO.3：5’-cagtGGTCTCagtca agaggtcaaggccatccaca-3’；

SEQ ID NO.4：5’-cagtGGTCTCaaaac tgtggatggccttgacctct-3’；

所述PCR扩增过程如下：按50μL体系的PCR反应，以上下游引物混合，经PCR仪变性退火得到gRNA片段；

3)CRISPR/Cas9表达载体的构建与农杆菌转化：

利用T4连接酶将步骤2)所得gRNA片段与经过BsaI/Eco31I酶切的CRISPR/Cas9质粒进行T4连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5a并用抗生素进行筛选后，做菌落PCR鉴定以及测序验证，得到表达载体；

将验证含有sgRNA的载体转化农杆菌，进行菌落PCR验证得到含有表达载体的农杆菌菌株；

(2)甘蓝型油菜BnaA06G0083400WE基因CRISPR/Cas9基因编辑突变体的获得与鉴定：

1)将预培养的下胚轴置于含有表达载体的农杆菌悬浮液中，进行愈伤的诱导，将产生愈伤的下胚轴转移至诱导诱导胚性愈伤生成的培养基上，进行胚性细胞的诱导，油菜遗传转化幼苗的分化与筛选同时进行，在分化培养基中加入相应的抗生素，分为初筛和二筛，得到阳性苗后进行幼苗生根培养；

2)利用PCR检测阳性甘蓝型油菜幼苗中的CRISPR/Cas9表达载体，通过测序检测CRISPR/Cas9基因编辑植株中BnaA06G0083400WE基因的编辑状况；

(3)验证甘蓝型油菜westar和BnaA06G0083400WE基因CRISPR/Cas9基因编辑突变体在株高方面的差异。

3.根据权利要求2所述的一种利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法，其特征在于，所述sgRNA靶位点的核苷酸序列选自甘蓝型油菜westar中BnaA06G0083400WE基因的第六个外显子区域。

4.根据权利要求2所述的一种利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法，其特征在于，所述抗生素为氯霉素。

5.一种由权利要求1-4任一项所述利用基因编辑技术创制甘蓝型油菜矮化材料的方法在油菜育种中的应用。