[发明专利]田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法

说明书

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种田阳番茄曲叶病毒，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。以及由含有该序列的病毒侵染性克隆、重组菌，由本发明提供的田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌具有较强的病毒侵染性和致病性，可以充分应用于大果番茄、樱桃番茄等番茄种质资源和品种抗性的评价及抗病材料的筛选、以及田阳番茄曲叶病毒基因组结构、致病机制解析等研究，为该病毒的深入研究提供重要工具。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病是番茄生产上一种毁灭性病害，已给我国造成严重的经济损失。引起番茄黄化曲叶病的病毒种类繁多，全球已报道的病毒至少有80多种，其中我国已报道的病毒至少有16种，这些病毒均属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)(http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)。

菜豆金色黄花叶病毒属病毒不能通过机械摩擦传播，通过注射接种侵染性克隆是该类病毒致病性等相关研究的一项简便可行的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种引起番茄黄化曲叶病的病毒侵染性克隆及其构建方法，还提供包含番茄黄化曲叶病病毒侵染性克隆的重组菌，及其相关应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种田阳番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Tianyang virus,ToLCTyV，除了这里的翻译外，为了和由包含该病毒序列具有侵染性的重组菌区别，涉及到该病毒的均以中文田阳番茄曲叶病毒表示)，该病毒的基因组大小分别为2750nt，为单链闭合环状，推导编码6个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，其中病毒链编码2个蛋白，AV1编码CP蛋白(293-1066nt)，AV2编码CP前体蛋白(133-483nt)，互补链编码4个蛋白，AC1编码复制酶(1515-2603nt)，AC2编码转录激活蛋白(1208-1615nt)，AC3编码复制增强蛋白(1063-1467nt)，AC4编码复制或转录调控因子(2189-2446nt)，基因间隔区含有与双生病毒复制起始有关的9碱基核苷酸“TAATATT/AC”基序。利用软件SDT 1.2的MUSCLE alignment程序分析结果表明，所获的田阳番茄曲叶病毒与胜红蓟黄脉病毒(ageratum yellow vein virus，AYVV)中国台南分离物Tainan的相似性最高(90.5％)，根据最新分类标准(Brown et al.,2015)，田阳番茄曲叶病毒是一个菜豆金色花叶病毒属新种，所述病毒的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆，所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆中含有田阳番茄曲叶病毒的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：将两个田阳番茄曲叶病毒基因组DNA片段构建到经SmaⅠ单酶切处理的植物表达载体上，得到田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆，所述田阳番茄曲叶病毒基因组DNA序列如SEQ IDNo.1所示。

进一步，田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法中，所述植物表达载体为pGreenⅡ0229载体。

进一步，田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法中，田阳番茄曲叶病毒基因组DNA片段可以由以下2种方法制备得到：

a.由田阳番茄曲叶病毒侵染发病植株中提取总DNA，以总DNA为模板，进行PCR扩增，获得病毒基因组DNA片段；PCR扩增的引物对如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，或PCR扩增的引物对如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；

b.人工合成如SEQ ID No.1所示序列，获得病毒基因组DNA片段。