[发明专利]腈水解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种腈水解酶突变体及其应用，腈水解酶突变体由NCBI登录号为Q03217.2的野生型腈水解酶突变所得，如：T171P/T173E/H181F/S188G；T171P/T173E/H181F/N146D；T171P/T173E/H181F/T225A等；N146D/T171P/T173E/H181F/T225A。本发明以野生型腈水解酶为基础，通过突变获得了能够高效催化较大位阻芳香族腈类底物的腈水解酶突变体，不仅酶活高，而且催化效率高。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及腈水解酶突变体、编码基因及其在制备对甲氧基苯甲酸或间氯苯甲酸的应用。

背景技术

腈(Nitrile)是一类非常重要的化合物，种类繁多，常见的如乙腈、丙烯腈、苯甲腈、苯乙腈、3-腈基吡啶等。由腈化合物出发可以获得酰胺、酸、酯等价值更高、应用范围更广的一类化合物，它们被广泛的应用于化工原料、医药中间体、维生素的前体。由于腈的化学水解需要强酸(或强碱)等苛刻的反应条件，并且副产物多、环境污染严重，极大地限制了其产业应用。

腈水解酶(Nitrilase)在有机合成和生物降解方面有着重要的作用，腈水解酶可以将腈转化成酸，在催化过程中，反应条件较温并且副产物较少，后续分离纯化工艺较简便。因此，已经在医药、环保、化工、食品添加剂、农业等化学品的生产方面得到了广泛的应用。腈水解酶根据底物偏好性可以分为脂肪族腈水解酶、芳香族腈水解以及芳基乙腈腈水解酶，其中有些腈水解酶可以同时具有催化脂肪族和芳香族腈类底物的活力，芳基乙腈腈水解酶一般具有对映选择性。在芳香族腈类底物中，由于底物自身的结构特征，一般是带有苯环、联苯等结构使得该类底物相较于脂肪族腈类底物而言空间位阻较大从而使得酶催化反应较为困难，并且不同侧链基团的电子效应也会影响酶催化反应，从而导致目前自然界中存在的野生型腈水解酶对这一类底物的催化活力普遍较低，往往达不到工业生产的要求。通过基因探矿技术能够从自然界这一巨大的“天然酶库”中筛选出对目标底物具有酶活的较优异的野生型菌株，基于此，通过理性设计、定向进化等方法对野生型进行改造后能够得到酶活、稳定性、选择性等多方面提高的且符合要求的工业生产要求的突变体菌株。

目前，在成百上千种芳香族腈类底物中，利用腈水解酶对3-氰基吡啶、扁桃腈、邻氯扁桃腈进行生物催化研究报道较多且较为成熟，而对于较大位阻芳香族腈类底物鲜有研究。

对甲氧基苯甲酸，又名为大茴香酸，分子式为C₈H₈O₃。对甲氧基苯甲酸是许多药物及香料的中间体。对甲氧基苯甲酸合成工艺目前仅涉及化学合成法，主要有以甲基苯酚为起始原料进行甲基化反应进行化学合成；以对羟基苯甲酸、对甲氧基苄醇、对甲氧基溴苯、对甲氧基苯乙酮等为原料合成对甲氧基苯甲酸，但此类方法原料成本高且需重金属催化对环境污染严重。相较化学合成法而言，生物酶法催化反应条件温和、对环境友好、能有效降低成本。间氯苯甲酸，分子式为C₇H₅ClO₂，主要作为医药中间体用于合成抗抑郁药物盐酸安非他酮的关键中间体α-溴代间氯苯丙酮；也可作为精细化工原料用于合成分子中含间氯苯环结构的精细化工产品同时还可作为其它医药、农药中间体等。其合成方法主要以化学合成法为主：由2-氨基-5-氯苯甲酸脱氨基而得产品收率只能达到89％；由间氯三氯甲苯水解环境污染大；由苯甲酸氯化而得但副产物较多，难以分离提纯；间氯甲苯高锰酸钾氧化法产品成本高环境污染大等化学合成方法。目前尚未有直接应用活性高的腈水解酶生物催化合成对甲氧基苯甲酸和间氯苯甲酸的研究报道。

鉴于此，特提出本发明。在研究对甲氧基苯腈及间氯苯腈的基础上，挖掘出一株对较大位阻芳香族腈类底物普遍具有催化活力的催化效率高、反应条件温和、符合绿色化学理念的腈水解酶突变体菌株，适应工业化生产的需求。

发明内容