[发明专利]一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法

说明书

本发明公开一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，属于水牛体外胚胎发育技术领域。该方法为在常规培养水牛卵母细胞的基础下，体外成熟培养液中添加氯化锂和褪黑素联合培养水牛卵母细胞，胚胎培养阶段继续添加褪黑素培养。在本发明中，研究对比夏冬季水牛胚胎体外生产效率和牛体内的褪黑素，发现夏季水牛胚胎的体外生产效率显著低于冬季，且夏季水牛血液中的褪黑素浓度显著低于冬季水牛，推定褪黑素可以影响水牛卵泡发育，进而影响卵母细胞成熟和胚胎发育。本技术方案中氯化锂作为Wnt/β‑catenin信号通路激活剂对水牛体外胚胎生产效率起到了良好的作用，因此添加褪黑素与氯化锂联合培养水牛卵母细胞，提高夏季水牛胚胎的体外生产效率。

技术领域

本发明涉及水牛体外胚胎发育技术领域，特别涉及一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法。

背景技术

热应激(HS)指在高环境温度中，机体所做的非特异性的生理反应的总和。热应激对家畜生产力有负面影响，而气候变化可能会加剧这些影响，特别会降低家畜的繁殖性能。

研究表明热应激显著降低牛、山羊、绵阳、猪和小鼠的受精率、受胎率和胚胎发育效率。而卵母细胞的质量是影响受精、胚胎发育、胎儿发育以及后代健康的最主要因素。卵母细胞容易受多种环境应激影响，热应激会降低猪卵母细胞质量、第一极体排出率和早期胚胎发育潜能。热应激会引起卵母细胞的细胞核、细胞质、胞质内细胞器(如皮质颗粒和线粒体)、细胞骨架、内质网等方面的变化；并促进细胞凋亡、增加ROS、降低ATP合成、下调HSPs和线粒体相关基因。此外，热应激还会引起负责卵丘细胞和卵母细胞物质转运的跨透明带突起(TZPs)和间隙连接(GJs)的变化。卵丘细胞一般保护卵母细胞抵抗各种外界环境的干扰，然而当在热应激环境下，卵丘细胞也可能将ROS转入卵母细胞内引起卵母细胞凋亡。

通过研究发现夏季水牛卵母细胞(活体采卵获得或屠宰场卵巢获得)的成熟率、分裂率和囊胚率均显著低于冬季。可见，缓解热应激对卵丘-卵母细胞复合体的影响可以提高夏季水牛胚胎生产效率进而推动水牛良种扩繁。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，旨在使用氯化锂(Licl)与褪黑素(MT)联合使用提高夏季水牛胚胎生产效率。

为实现上述目的，本发明提供一种提高夏季水牛胚胎生产效率的方法，所述方法为：

S1，获取水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)；

S2，将所述水牛卵丘-卵母细胞复合体放入培养液中进行体外成熟培养，所述培养液成分中含有氯化锂(LiCl)和褪黑素(MT)；

S3，取S2中进行体外成熟培养后的水牛卵丘-卵母细胞复合体，转入覆盖石蜡油的IVM液微滴内培养，得到成熟水牛卵丘-卵母细胞复合体；

S4，将S3中的成熟水牛卵丘-卵母细胞复合体转入体外受精(IVF)液微滴中，与水牛精子共同孵育22-24h完成体外受精，得到受精后的水牛卵丘-卵母细胞复合体；

S5，将受精后的水牛卵丘-卵母细胞复合体吹打去除卵丘细胞后，用胚胎培养液清洗，转入含卵丘细胞单层的胚胎培养液微滴进行胚胎培养，获得水牛体外生产胚胎。

可选地，所述S2中用于进行体外成熟培养的培养液包括以下成分：

体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、4～6ng/mL的卵泡刺激素(FSH)、8～12ng/mL的黄体生成素(LH)、0.1～0.3mM的丙酮酸钠(C₃H₃NaO₃)、0.5～1.5μg/mL的雌二醇(E2)、45～50μM的半胱氨酸(Cys)、20～30ng/mL的表皮生长因子(EGF)、10μM的氯化锂(Licl)；10^-9M的褪黑素(MT)，余量为TCMl99培养基。

可选地，所述S2中用于进行体外成熟培养的培养液包括以下成分：