[发明专利]采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌

说明书

本发明公开了采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌，所述基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA为出发菌株，将SrfAD和/或YbdT关键限速酶基因的转化到贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA所得。本发明构建得到基因工程菌ΔRapF+SerA+SrfAD和ΔRapF+SerA+SrfAD+YbdT在发酵条件下用于高效生产表面活性素产量，两个关键限速酶基因的组成型表达，成功地将表面活性素进一步提高，在最佳培养基条件下，在5L发酵罐40‑50h可稳定生产表面活性素约18.2g/L与19.6g/L，该基因工程菌为加速表面活性素的产业化提供原材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌。

背景技术

表面活性剂是由枯草杆菌和相关物种产生的一种环状脂肪七肽内酯，它包含两个酸性氨基酸(Glu和Asp)，旁边有五个非极性残基和一个3-羟基脂肪酸。由于其出色的表面活性和抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原生质的活性，它具有广泛的生物技术和治疗应用。然而，本地芽孢杆菌菌株的产量表面活性剂通常为每升几十毫克，很少超过每升1克。这使得表面活性剂的生产非常昂贵，从而限制了表面活性剂进入实际应用。通过物理化学诱变和本地芽孢杆菌菌株的发酵优化来提高表面活性剂的生产，已经得到了广泛和深入的研究。最近，基于表面活性剂的生物合成途径和分子调控机制的基因工程方法来提高芽孢杆菌的表面活性剂产量受到了极大关注。

表面活性剂的生物合成是由srfA基因组编码的SrfAA-D多酶复合体进行的，该基因组横跨39kb，由四个基因组阅读框相应组成。除了srfA这个合成表面活性剂的核心基因组外，其他一些在芽孢杆菌中独特存在的关键酶也在表面活性剂的生物合成中发挥了关键作用。修饰肽合成酶中肽基载体蛋白域的磷泛酰转移酶sfp可以将SrfAA-C从apo形式转化为holo-synthase。细胞色素P450酶YbdT催化长链脂肪酸形成3-羟基脂肪酸，然后长链脂肪酸-CoA连接酶LcfA和LcfB催化3-羟基脂肪酸形成脂肪酰基CoA用于表面活性剂生物合成。一些参与脂肪酸、氨基酸和辅助因子代谢的酶对表面活性剂的合成也很重要，它们的功能已被充分研究。总之，对表面活性剂合成途径的阐明，为通过代谢途径工程提高其产量奠定了基础。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一类高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株，本发明将两个关键酶SrfAD和YbdT的完整基因片段分别插入pTN-psrfT1T2和pTC-PlacI-IPTGT1T2载体，成功构建了pTN-PsrfT1T2-SrfAD和pTC-PlacI-IPTGT1T2-YbdT，然后将上述构建的表达载体逐一转化到贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA中，构建得到全新的高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株，可以通过关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素。

本发明还提供所述基因工程菌的构建方法与应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA为出发菌株，将SrfAD和/或YbdT关键限速酶基因的转化到贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA所得；所述贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA是以贝莱斯芽孢杆菌HCK2出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因RapF和SerA所得。

其中，所述关键限速酶SrfAD和YbdT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SrfAD和YbdT基因核苷酸序列设计引物，以枯草芽孢杆菌的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到SrfAD和YbdT基因片段；