[发明专利]采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌

权利要求书

1.一种采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA为出发菌株，将SrfAD和/或YbdT关键限速酶基因的转化到贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA所得；所述贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA是以贝莱斯芽孢杆菌HCK2出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因RapF和SerA所得。

2.根据权利要求1所述的采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌，其特征在于，所述关键限速酶SrfAD和YbdT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求1所述的采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以SrfAD和YbdT基因核苷酸序列设计引物，以枯草芽孢杆菌的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到SrfAD和YbdT基因片段；

(2)采用限制性内切酶对SrfAD基因片段和质粒进行双酶切，得到酶切基因片段和线粒质粒片段，经酶连，得到重组质粒pTN-PsrfT1T2-SrfAD；

(3)采用限制性内切酶对YbdT基因片段和质粒进行双酶切，得到酶切基因片段和线粒质粒片段，经酶连，得到重组质粒和pTC-PlacI-IPTGT1T2-YbdT；

(4)重组质粒pTN-PsrfT1T2-SrfAD和pTC-PlacI-IPTGT1T2-YbdT，转入贝莱斯芽孢杆菌突变菌株ΔRapF+SerA中，构建得到突变菌株贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA+SrfAD和贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA+SrfAD+YbdT。

4.根据权利要求3的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的引物序列优选如下：

SrfADF：5′-TTTGGATCCAAGGTGAGTGTGAGATGCTT-3′

SrfADR：5′-TTTCCATGGGATCTGAAAGAAGGCAGGAA-3′

YbdTF：5′-TTTGCTAGCCGGCGAAGGTGTTTTATGAT-3′

YbdTR：5′-TTTACTAGTTAAATCAAGCAGCACCGATG-3′。

5.根据权利要求3的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的限制性内切酶为Nhe I和Spe I，所述质粒为表达载体pTN-PsrfT1T2；步骤(3)所述的限制性内切酶为BamH I和NcoI；所述质粒为表达载体pTC-PlacI-IPTGT1T2。

6.根据权利要求5的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述重组质粒pTN-PsrfT1T2-SrfAD转入贝莱斯芽孢杆菌突变菌株ΔRapF+SerA中，构建得到突变菌株贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA+SrfAD；再转入重组质粒pTC-PlacI-IPTGT1T2-YbdT得到贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA+SrfAD+YbdT。

7.一种权利要求1所述的采用关键酶SrfAD和YbdT协同提高芽孢杆菌高产表面活性素的基因工程菌在生产表面活性素中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生产表面活性素为基因工程菌进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8到7.2，温度维持在35-37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期40-50h。