[发明专利]一种BDDE修饰的透明质酸寡糖的分离方法

说明书

本发明公开了一种BDDE修饰的透明质酸寡糖的分离方法，采用LC‑HRMS联用对BDDE交联透明质酸的酶解寡糖进行分离，通过优化色谱类型与分离条件，能够实现酶解液中不同形态修饰寡糖的有效分离，降低了离子化抑制对寡糖定量结果的影响，实现了更为准确的寡糖定量检测。与现有GPC色谱柱、寡糖分离常用的二醇基亲水色谱柱（Luna‑Hilic）和硅胶亲水色谱柱（BEH‑Hilic）相比，本发明酰胺色谱柱（BEH‑Amide）对代表性寡糖目标物具有更好的分离度以及检测灵敏度，为修饰度的准确分析奠定了基础。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体地，涉及一种BDDE修饰的透明质酸寡糖的分离方法，还涉及BDDE交联透明质酸修饰度的测定方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种天然存在于动物细胞间质中的线性多糖，由葡萄糖醛酸与N-乙酰葡萄糖胺组成的双糖单元重复连接形成，其化学结构为(-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-)_n，相对分子量从几万至上百万不等。由于HA溶液具有较高的黏性、极强的保水能力与很好的生物相容性，近年来其在医疗和医美领域中的应用愈发广泛：眼科手术、骨关节黏液补充、真皮填充等过程中都会涉及到高分子量HA。

外源性HA进入人体后会被体内的透明质酸酶降解。为了提高HA的力学性能并延长其在人体内发挥作用的持续时间，可以通过共价交联剂将HA糖链交联形成三维网状结构，这种网状结构在水中溶胀形成HA水凝胶。HA水凝胶已成为一种重要的功能性材料，其机械和物理性能取决于交联程度和交联方式。研究表明，过高的修饰和交联程度可能会影响HA水凝胶的生物相容性和安全性。为解析HA水凝胶结构与功能的对应关系，建立相关产品的质控标准，研究交联参数的精确表征方法具有非常重要的意义。

1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)是目前最为常用的交联剂，使用BDDE交联获得的HA水凝胶已被证明具有较高的生物相容性和低毒性。在碱性条件下，BDDE的环氧结构与HA分子上的羟基发生亲核反应，形成1,4-丁二醇二(丙烷-2,3-二元醇)醚(BDPE)衍生物，反应式如下。BDDE和HA的结合方式有两种，一种是BDDE两端均与HA结合，这种称之为交联修饰，另一种是BDDE仅一端与HA结合，另一端游离，这种称之为悬挂修饰。对于采用BDDE交联剂制备的HA衍生物而言，尽管其具有相同的起始材料，但所得产品的物理性质可能具有很大差别，其物理性质的不同可归因于关键结构参数的差异，例如i)起始材料(HA)的分子量和多分散性；ii)修饰程度；iii)交联剂在HA上的取代位置等。

经BDDE交联修饰的HA分子量大且在水中的溶解度差，在对其进行修饰度表征时，通常采用工具酶(透明质酸酶或硫酸软骨素酶ABC等)将其降解为寡糖片段。受到BDDE交联剂的影响，工具酶无法实现将交联HA完全降解为HA二糖，产物中会出现多种分子量与修饰程度、修饰方式不同的寡糖片段(如图1所示)。例如，2-B用来表示发生了悬挂修饰的二糖；2-B-2用来表示发生了交联修饰的二糖。通过对不同寡糖结构进行相对定量分析，可以表征产品的修饰度与修饰方式。目前尚无交联HA寡糖结构表征相关专利，杨彪等(杨彪,郭学平,臧恒昌,等.交联透明质酸凝胶修饰度的测定方法研究进展[J].药物生物技术,2015(2):4.)采用分子排阻色谱与质谱联用的方法(GPC-MS)对寡糖片段进行相对定量分析，然而，该方法具有以下缺陷，导致寡糖定量与修饰度表征结果不准确：

1)GPC色谱柱根据目标物分子量大小不同实现分离。交联HA酶解后产生的部分寡糖片段分子量接近，这些片段无法通过GPC实现有效分离，并出现洗脱时间重叠的现象。在电喷雾过程中，洗脱时间重叠的寡糖会发生离子化相互抑制，导致相关结构的定量结果比实际值偏低。

2)论文中采用低分辨质谱作为检测器，只能测定出目标寡糖小数点后1位的质核比(m/z)，这可能导致目标寡糖的定量分析受到与其m/z相近的杂质干扰，影响定量结果的准确性。