[发明专利]一种BDDE修饰的透明质酸寡糖的分离方法

权利要求书

1.一种BDDE修饰的透明质酸寡糖的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：

使用高效液相色谱-高分辨质谱联用技术对修饰的透明质酸寡糖进行分离，

其中，高效液相色谱-高分辨质谱联用技术中使用酰胺色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，

流动相A为甲酸铵水溶液或乙酸铵水溶液，流动相B为甲酸铵的乙腈水溶液或乙酸铵的乙腈水溶液。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，流动相A中，甲酸铵水溶液或乙酸铵水溶液中甲酸铵或乙酸铵的浓度均为5-10 mM。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，流动相B中，甲酸铵的乙腈水溶液或乙酸铵的乙腈水溶液中，甲酸铵或乙酸铵的浓度均为5-10 mM，乙腈水溶液中乙腈浓度为90-95wt%。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，液相色谱中色谱柱的柱温为22-40℃。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，液相色谱中使用的流速为0.2-0.3mL.min^-1。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述酰胺色谱柱为BEH Amide色谱柱。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，高效液相色谱-高分辨质谱联用技术的质谱条件为：负离子扫描模式；鞘气流速10-20 arb；辅助气流速： 0-5 arb；喷雾电压：3-4 KV；毛细管温度： 250-350 ℃；S-Lens RF Level： 30-70 %V。

8.一种BDDE交联透明质酸修饰度的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括以下步骤：

（1）酶解交联透明质酸得到修饰的透明质酸寡糖；

（2）利用权利要求1-7中任意一项所述的BDDE修饰的透明质酸寡糖的分离方法对修饰的透明质酸寡糖进行分离；

（3）高效液相色谱-高分辨质谱分析后，根据被检测到离子的化学式与其对应峰面积，按照各离子单同位素峰占比，计算得到全同位素峰峰面积和；对得到的寡糖结构进行归类，将同一结构而不同价态离子、同一结构而不同加合物形态离子的寡糖归为同一种结构的寡糖，计算归类后的寡糖的峰面积，按照修饰度的公式进行修饰度计算；

修饰度=∑（含有BDDE寡糖结构的峰面积*该寡糖中BDDE个数）/∑（各寡糖结构的峰面积*该寡糖中HA二糖的重复次数）。