[发明专利]以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法

说明书

本发明提供了一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：(一)粗纯沉淀制备；(二)溶解过滤；(三)S/D病毒灭活；(四)capto q xp凝胶色谱层析；(五)超滤透析；(六)冻干及干热灭活。本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，制备过程中工艺简单，减少工艺中离心步骤，单步凝胶吸附，有效提高产品纯度；包含两步病毒灭活步骤，可灭活已知的脂包膜/非脂包膜病毒，临床病毒安全性得到极大的保障。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法。

背景技术

人纤维蛋白原是一个含有2964个氨基酸残基、相对分子质量为340KD、具有对称的二聚体结构的血浆可溶性糖蛋白，血浆中含量高达2～4g/L。在人凝血系统中发挥着关键作用，凝血的最后阶段是人纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变为人纤维蛋白，人纤维蛋白和其他血细胞成分聚集成不溶性团状物达到止血的目的。除直接参与凝血过程外，还在血小板聚集，血液粘度方面起着重要作用，是心、脑血管病发病的重要原因。

人纤维蛋白原的生产工艺的研究主要有：国内部分企业采用低温乙醇沉淀的生产方法，工艺路线：血浆经8％乙醇沉淀，溶解后S/D病毒灭活，15％乙醇沉淀，溶解后超滤除醇，过滤除菌，分装冻干而成。国内也有部分企业，以冷沉淀为原料，用离子交换层析收集流穿液，经甘氨酸多次沉淀，超滤浓缩，分装冻干而成。德国CSL Behring公司产品工艺路线是：采用冷沉淀为起始原料，经过多次Al(OH)₃吸附和甘氨酸沉淀工艺，以及巴氏灭活法(60℃/10h)进行病毒灭活，最终获得纯度高、安全性好的制品。

低温乙醇工艺是利用等电点、蛋白质浓度、温度、离子强度等因素来实现蛋白分离，在蛋白质沉淀时会有共沉现象，易引起纤维蛋白原变性，产品纯度在75％左右。离子交换层析收集流穿液，过程涉及到多次离心分离，增加能耗，周期较长。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种能提高产品纯度，缩短周期，降低能耗的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：

(一)粗纯沉淀制备

(1)以冷沉淀为原料，将冷沉淀切碎，加入到6.5倍24-26℃含肝素钠3IU/g的注射用水中溶解，搅拌溶解1-2h，离心后过滤；

(2)收集步骤(1)中过滤后液体，用0.5mol/L的乙酸调节pH至6.0-7.0，温度降至8-12℃，离心获得粗纯沉淀；

(二)溶解过滤

将步骤(2)中所述粗纯沉淀用溶解液溶解，20-30℃搅拌1h，粗纯沉淀溶解液用0.45μm滤板过滤；

(三)S/D病毒灭活

步骤(二)中过滤后液体在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，在24-26℃保温6h；灭活后液体加入等倍体积的注射用水终止灭活；

(四)capto q xp凝胶色谱层析

(a)用capto q xp凝胶装填柱子，用平衡液进行平衡；

(b)上样，将步骤(三)中灭活后液体进行上样，上样量为凝胶体积的3-5倍，上样速度为6-8mL/min；

(c)洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；

(d)洗脱，用洗脱液进行洗脱；

(五)超滤透析

收集步骤(d)中洗脱后溶液，用透析液透析5-6遍，获得透析浓缩液，即为人纤维蛋白原原液；