[发明专利]以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法

权利要求书

1.一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)粗纯沉淀制备

(1)以冷沉淀为原料，将冷沉淀切碎，加入到6.5倍24-26℃含肝素钠3IU/g的注射用水中溶解，搅拌溶解1-2h，离心后过滤；

(2)收集步骤(1)中过滤后液体，用0.5mol/L的乙酸调节pH至6.0-7.0，温度降至8-12℃，离心获得粗纯沉淀；

(二)溶解过滤

将步骤(2)中所述粗纯沉淀用溶解液溶解，20-30℃搅拌1h，粗纯沉淀溶解液用0.45μm滤板过滤；

(三)S/D病毒灭活

步骤(二)中过滤后液体在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，在24-26℃保温6h；灭活后液体加入等倍体积的注射用水终止灭活；

(四)capto q xp凝胶色谱层析

(a)用capto q xp凝胶装填柱子，用平衡液进行平衡；

(b)上样，将步骤(三)中灭活后液体进行上样，上样量为凝胶体积的3-5倍，上样速度6-8mL/min；

(c)洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；

(d)洗脱，用洗脱液进行洗脱；

(五)超滤透析

收集步骤(d)中洗脱后溶液，用透析液透析5-6遍，获得透析浓缩液，即为人纤维蛋白原原液；

(六)冻干及干热灭活

将步骤(五)得到的浓缩液按2-3％蛋白含量进行配制，冻干；冻干结束后进行100℃干热灭活30min，获得人纤维蛋白原产品。

2.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(二)中所述溶解液配方为：0.02mol/L枸橼酸钠、0.03mol/L氯化钠、0.02mol/L g盐酸精氨酸，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5。

3.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(三)中具体步骤为：步骤(二)中过滤后液体按重量10:1比例在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％，在24-26℃保温6h；灭活后液体加入等倍体积的注射用水终止灭活。

4.根据权利要求3所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：所述S/D溶液为Tween-80和磷酸三丁酯，使用前进行预配，预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。

5.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(a)中所述平衡液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5。

6.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(c)中所述洗涤液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5；步骤(d)中所述洗脱液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.5-1mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5。

7.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(五)中所述透析液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠，盐酸精氨酸0.15-0.25mol/L，pH 6.8-7.2。

8.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(五)中将洗脱液超滤透析至电导率10-30Ms/cm，pH 6.5-7.5。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(一)中粗纯沉淀中人纤维蛋白原纯度为40％。

10.权利要求1-9任意一项所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法制备得到的人纤维蛋白原。