[发明专利]一种寡糖的分离纯化方法及应用

说明书

本发明公开了一种寡糖的分离纯化方法及应用，采用酶解法、化学沉淀法和膜法相结合。该方法条件温和、工艺简单、耗时短，且生成的沉淀可以用于肥料等领域。且该方法不会影响目的寡糖的收率。

技术领域

本发明涉及系列唾液酸化乳N四糖的高效制备方法，同时提供了寡糖的分离纯化方法。

背景技术

寡糖又称为低聚糖，是指2～10个单糖通过糖苷键连接而成的直链或者支链的一类糖，寡糖典型之一的母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMOs)，作为母乳中仅次于脂质和乳糖的第三大固体物质，浓度高达9-24g/L。其在食品行业尤其是婴幼儿配方奶粉具有广阔的市场前景，但由于从哺乳动物母乳中分离纯化母乳低聚糖过程复杂且产量少，导致现在寡糖多是基于化学法或者酶法、细胞工厂发酵来获得。而化学法需要严谨的设计，包括保护基团、选择催化剂和合适的反应条件。酶法和细胞工厂发酵通常是在温和的条件下进行的，不需要某些复杂的步骤，通常是在细胞体内或者体外，通过各种酶的作用来实现寡糖的合成，这些酶通常包括各种糖基转移酶、糖苷水解酶以及磷酸化酶。而糖基转移酶的作用是高效而专一的地把糖基从糖核苷酸供体上催化到受体上。但是由于糖核苷酸价格昂贵，且生成的核苷酸磷酸通常会使糖基化路径受到十分明显的反馈抑制作用，因此，在这类体系中，需要加入糖核苷酸再生系统。尤其在酶法合成寡糖的糖核苷酸再生系统中，会产生大量的磷酸根，而细胞工厂发酵生产母乳低聚糖的发酵培养基中会加入磷酸盐。基于此发酵液或者反应液中会存在大量的磷酸根多价阴离子，这些磷酸根的存在对寡糖的分离提出了巨大的挑战。

就目前的化学合成、酶促合成和基于发酵的制备方法，实际上也面临着难以实现具有足以用于食品应用质量的寡糖尤其是HMOs产物的大规模制备。原因是化学合成需要几种有毒的化学物质，其可能污染最终产物。然而，酶促方法和基于发酵方法倾向于产生低聚糖的复杂混合物，使得所需产物被起始物料如乳糖，以及中间体、不需要的副产物(例如源自某些糖基转移酶的副活性的副产物)和底物如各单糖和多肽污染。具体来说，母乳低聚糖在基因工程菌或者酶法生物合成过程中均是使用糖基转移酶从头合成，例如，合成含有5个糖单元的母乳低聚糖，意味着需要从从二糖开始，在糖基转移酶作用下依次合成三糖、四糖和五糖，该生物合成过程中会获得含有目的寡糖的化合物，即反应混合物或者细胞发酵液，其中包含着少量的残留底物以及中间过程的产物(非目的寡糖)，以及一些无机离子。且这些非目的寡糖的结构和物理化学性质往往和目的寡糖非常相近，且相邻反应过程得到的寡糖分子量只相差一个糖单元。此外，值得一提的是，特别是含有重组微生物(细菌或真核微生物，如巴氏酵母)的基因工程发酵液比乳源产品流更是复杂得多。例如，乳清的组成为～94％的水、4-5％的乳糖、0.5-1％的蛋白质和仅有的很少的已经确定的矿物质(如钙、钾和磷)，还有一些维生素，仅在乳品流中浓缩和脱矿质的简单的基质。相比之下，从重组微生物发酵工艺中获得的糖溶液的基质非常复杂，首先是根据规定要求分离重组生物质并使其失活，获得的澄清液是包含不同盐类和离子的不确定基质，还含有重金属和微量元素，其次此类液体的挑战是除去细胞碎片、膜碎片如脂类、蛋白质、源自微生物细胞代谢的分子。因此，与乳清和乳品流相比，通过重组加工助剂(如基因修饰细菌)生产的寡糖的回收更具挑战性，因为其内的污染物在分子量、带电分子(单电荷和多电荷)和着色分子方面差异性都非常高。

基于上述，不难发现生物酶法和基于发酵方法倾向于产生低聚糖的复杂混合物的主要原因是，生物酶法反应液或者发酵方法的发酵液中，除了所期待的目标寡糖以外，至少存在着以下所不期望存在的物质：

1)寡糖的产物类似物；所述产物类似物包括，分子量低于待纯化的低聚糖或者唾液酸化的低聚糖的分子量的化合物，所述化合物包括发酵或者酶法反应所需要的糖类底物以及在各类糖基转移酶作用下生成的各级寡糖中间产物；例如在LST-a的酶法合成中，可能会出现乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、N乙酰氨基葡萄糖、半乳糖四种底物的残留，以及LNTⅡ(乳糖-N-三糖)和LNT(乳糖-N-四糖)两个中间产物的残留。