[发明专利]一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法

说明书

本发明属于分子生物学和基因检测技术领域，公开了一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法，phoQ基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375GT、c.749TA、c.1175GA、c.1154GA、c.881GA五种突变中的一种；phoQ基因突变体的核苷酸序列为SEQIDNO：1～5。本发明将带有SNP突变的基因克隆到原始不含突变位点的菌株中，原始菌株对多粘菌素的MIC值上升4～8倍，证实了SNP突变可介导多粘菌素耐药；通过检测phoQ突变基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因检测技术领域，尤其涉及一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法。

背景技术

目前，多粘菌素(polymyxin)是从多粘杆菌培养液中获得的一种多肽类抗生素，包括5种不同的类型(多粘菌素A，B，C，D和E)，目前仅多粘菌素B(polyB)和多粘菌素E(polyE)用于临床。多粘菌素带有5个游离氨基，在生理pH下呈正电荷，能够与革兰氏阴性菌外膜上脂多糖(LPS)的带负电荷的磷酸根产生静电吸引，导致Ca²⁺，Mg²⁺离子不能在LPS表面稳定存在，致使细菌外膜结构混乱，渗透性增加；然后多粘菌素进入细菌外膜，损伤细胞质膜，导致内含物外泄，使细菌死亡。且多粘菌素对生长繁殖期和静止期的细菌都有效，与其他抗生素之间交叉耐药较少。20世纪40年代得到认可，20世纪50年代后期应用于临床。但在20世纪70年代时，由于它们潜在的肾毒性和神经毒性以及其他毒性较低的抗生素的出现，使得多粘菌素的使用频率降低。近些年，多粘菌素在其他药物治疗无效的革兰氏阴性杆菌感染如多重耐药细菌(MDR)和泛耐药细菌(XDR)的挽救性治疗方案中扮演着重要的角色。

phoQ基因编码的PhoQ蛋白具有组氨酸激酶活性，通过磷酸化活化PhoP，PhoPQ通过调节arnBCADTEF操纵子来控制脂多糖(LPS)修饰，以合成4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)和磷酸乙醇胺(pEtN)并将其添加到脂多糖(LPS)的脂质A上。这种修饰增加了多粘菌素初始靶标LPS的电荷，因此降低了与多粘菌素的结合，导致这些菌株对多粘菌素的耐药。

PhoPQ双组分调控系统可通过脂多糖修饰途径介导多粘菌素耐药。目前已报道phoQ基因多个位点的SNP突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过可介导多粘菌素耐药的phoQ基因的c.1375GT、c.749TA、c.1154GA、c.1175GA、c.881GA这5个突变位点。本发明针对以上SNP突变进行了克隆验证，将带有SNP突变的基因克隆到原始不含突变位点的菌株中，原始菌株对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)，证实了这些SNP突变可介导多粘菌素耐药。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前已报道phoQ基因多个位点的SNP突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过可介导多粘菌素耐药的phoQ基因的c.1375GT、c.749TA、c.1175GA、c.1154GA、c.881GA这5个突变位点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法。

本发明是这样实现的，一类phoQ基因突变体，所述phoQ基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375GT、c.749TA、c.1175GA、c.1154GA、c.881GA五种突变中的一种。