[发明专利]一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法

权利要求书

1.一类phoQ基因突变体，其特征在于，所述phoQ基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375GT、c.749TA、c.1175GA、c.1154GA、c.881GA五种突变中的一种。

2.如权利要求1所述phoQ基因突变体，其特征在于，所述phoQ基因突变体的突变基因120027_1B_phoPQ^G1375T的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，突变基因120027_2B_phoPQ^T749A的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，突变基因120027_4B_phoPQ^G1175A的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，突变基因120027_5B_phoPQ^G1154A的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，突变基因120027_6B_phoPQ^G881A的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。

3.一种如权利要求1～2任意一项所述phoQ基因突变体在制备用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的试剂盒中的应用。

4.如权利要求3所述phoQ基因突变体在制备用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的试剂盒中的应用，其特征在于，所述用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的试剂盒通过检测所述phoQ基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，进而实现阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测。

5.一种实施如权利要求1～2任意一项所述phoQ基因突变体的phoQ基因突变体的验证方法，其特征在于，所述phoQ基因突变体的验证方法包括以下步骤：

步骤一，设计引物：根据120027_1B、120027_2B、120027_4B、120027_5B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物；

步骤二，目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增，分别得到120027_1B_phoPQ^G1375T、120027_2B_phoPQ^T749A、120027_4B_phoPQ^G1175A、120027_5B_phoPQ^G1154A、120027_6B_phoPQ^G881A；

步骤三，pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4h，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；

步骤四，pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16℃条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQ^G1375T、pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQ^T749A、pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQ^G1175A、pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQ^G1154A、pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQ^G881A；

步骤五，将步骤四中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到受体菌株阴沟肠杆菌120027_A中，分别得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQ^G1375T、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQ^T749A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQ^G1175A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQ^G1154A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQ^G881A；

步骤六，多粘菌素MIC：对通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测多粘菌素E的MIC；通过Crispr-Cas9系统对120027_A菌株敲除phoPQ基因，得到120027_A_ΔphoPQ敲除菌株，再将120027_4B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因成功克隆进pET28a(+)-rmtB载体，并通过电穿孔转化至120027_A_ΔphoPQ受体菌，分别得到120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQ^G1175A、120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQ^G881A重组菌株，检测多粘菌素E的MIC。