[发明专利]一种高灵敏度甘胆酸单链抗体及其筛选方法与应用

权利要求书

1.一种高灵敏度甘胆酸单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，其特征在于，所述的氨基酸序列由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的重链可变区、核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的连接肽和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的轻链可变区组成，所述的连接肽位于重链可变区和轻链可变区之间。

4.权利要求1或者2所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1)合成免疫抗原

首先制备半抗原，将半抗原溶于溶液中，加入二环己基碳二亚胺和NHS，室温下搅拌反应；最后，离心取上清滴入牛血清白蛋白中，室温下搅拌反应，在PBS中透析得到异源包被抗原；

2)动物免疫

免疫宿主用磷酸盐缓冲液对甘胆酸免疫抗原进行稀释为1mg/mL，与等体积的弗氏佐剂乳化后进行免疫来亨鸡5次；

3)抗体库的构建

分离免疫后的来亨鸡脾脏的淋巴细胞，提取总RNA并逆转录合成cDNA，扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因，通过overlapPCR组装成scFv，与pCom3X质粒连接，点击转化至EcoliER2738感受态细胞中，构建原始抗体文库，并加入辅助噬菌体VCSM13，得到噬菌体抗体文库；

4)特异性单链抗体的淘选

利用步骤1)制备的异源包被抗原包被酶标板，加入噬菌体抗体文库，室温下孵育1小时，用PBST洗涤未结合的噬菌体，然后添加甘胆酸洗脱结合的噬菌体，重复上述操作4次，筛选出灵敏度较高的噬菌体；

5)特异性单链抗体的表达

提取阳性噬菌粒，热击转化至E.coliTOP10F′表达宿主菌中，加入IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，利用镍亲和层析柱进行纯化，得到高灵敏的抗甘胆酸单链抗体。

5.根据权利要求4所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，将2g甘胆酸溶于10mL甲醇中，加入0.3mL浓硫酸，100℃加热回流进行酯化反应，利用乙酸乙酯进行萃取得到甘胆酸甲酯；然后，将0.1g甘胆酸甲酯溶于100mL氯仿中，在0.1mL三乙胺的催化作用，与0.2g琥珀酸酐进行反应，得到半抗原。

6.根据权利要求4所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，所述的免疫抗原通过下述方法制得：将0.11mmol甘胆酸溶于1mLDMF中，加入0.22mmolDCC和0.22mmolNHS，室温下搅拌反应，离心取上清滴入5.5μmol卵清白蛋白，室温下搅拌反应，在PBS中透析得到包被抗原。

7.根据权利要求4所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，所述的扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因的方法用核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的上游引物CSCVHo-F和核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的下游引物CSCG-B扩增抗体重链可变区基因；利用核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的上游引物CSCVK和核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的下游引物CKJo-B扩增抗体轻链可变区基因VL。

8.根据权利要求7所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，所述的增重链可变区VH和轻链可变区VL基因的体系如下：

10×PCR缓冲液1μL，

10mMdNTPmix 1μL，

10μM上游引物1μL，

下10μM游引物1μL，

cDNA 500ng；

TaqDNA酶1μL，

灭菌水To50μL；

扩增条件：

预变性98℃，120s；

变性98℃，30s；

退火56℃ 15s；

延伸72℃ 90s；

重复变性、退火、延伸25个循环；

最后延伸72℃ 10min

冷却4℃+∞。