[发明专利]一种高灵敏度甘胆酸单链抗体及其筛选方法与应用

说明书

本发明公开一种高灵敏度甘胆酸单链抗体及其筛选方法与应用，旨在提供一种具有高灵敏性，可用于甘胆酸的快速免疫检测，具有良好的应用价值的甘胆酸单链抗体；该其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述单链抗体是以甘胆酸免疫原免疫动物，利用异源包被抗原进行筛选所得；涉生物技术领域。

技术领域

本发明属于基因工程、抗体工程技术领域和免疫学检测领域，涉及一种以异源包被抗原筛选高灵敏度甘胆酸单链抗体的方法。

背景技术

甘胆氨酸(Glycocholicacid,GCA)，属于二级胆酸，是类固醇酸的衍生物，由胆酸和甘氨酸在肝脏中结合生成的结合型胆酸，是胆汁酸的主要成分之一。GCA具有促进脂类乳化，加速脂类物质的消化和吸收的作用。甘胆氨酸在血液和尿液中的浓度高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。因此，建立甘胆氨酸检测方法对其进行有效监测可以为各类肝脏疾病的鉴别、诊断、治疗和预后分析提供重要的依据。

目前，GCA的检测方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、免疫学分析法等等。免疫分析法基于抗体和抗原之间特异性结合，具有灵敏度高、特异性强、简单、快速和便宜等优点，特别适用于大批量样本的筛查。

抗体是影响免疫分析方法特异性和灵敏性的重要因素之一。传统的抗体包括多克隆抗体(polyclonalantibodies，pAb)和单克隆抗体(monoclonalantibodies，mAb)；然而，这两种抗体存在着某些缺点，例如在多克隆抗体制备中批次与批次之间的差异；在单克隆抗体制备中耗时、生产成本高和步骤复杂等等。通过噬菌体展示技术，可以从抗体文库中淘选到具有高亲和力的重组抗体，并可通过测序获得抗体的编码序列。单链抗体(single-chianvariablefragment，scFv)是最常见的重组抗体之一，是能够保持与抗原有效结合的最小单位，由轻链和重链抗体可变区通过一段编码连接肽基因拼接后表达的重组蛋白。单链抗体具有易于原核表达和基因工程改造等优点，目前已广泛应用于医疗诊断、疾病治疗、环境监测和食品安全分析等领域。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，本发明的第一个目的是提供一种具有高灵敏性，可用于甘胆酸的快速免疫检测的高灵敏度甘胆酸单链抗体。

本发明的第二个目的是以异源包被抗原筛选高灵敏度甘胆酸单链抗体的方法。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种高灵敏度甘胆酸单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，所述的氨基酸序列由核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的重链可变区、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的连接肽和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区组成，所述的连接肽位于重链可变区和轻链可变区之间。

本发明提供的第二个技术方案是这样的：

第一个技术方案提供的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，依次包括下述步骤：

1)合成免疫抗原

首先制备半抗原，将半抗原溶于溶液中，加入二环己基碳二亚胺和NHS，室温下搅拌反应；最后，离心取上清滴入牛血清白蛋白中，室温下搅拌反应，在PBS中透析得到异源包被抗原；

2)动物免疫

免疫宿主用磷酸盐缓冲液对甘胆酸免疫抗原进行稀释为1mg/mL，与等体积的弗氏佐剂乳化后进行免疫来亨鸡5次；

3)抗体库的构建