[发明专利]智能手机APP结合DSN酶微流体芯片比色检测miRNA-21的方法

说明书

本发明公开了具体为智能手机APP结合DSN酶微流体芯片比色检测miRNA‑21的方法，所述方法通过使用智能手机APP成像技术，对PDMS芯片中比色区域进行拍照成像。最后通过Image J软件检测照片灰度值的方法定量分析糖尿病伴冠心病患者血液中的miRNA‑21浓度。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所述方法设计了基于微流控芯片的智能手机成像系统用于检测miRNA‑21，具有较宽的线性范围，操作简单，检测时间较短等优点。除此以外，脂质体封装的葡萄糖氧化酶为该策略提供了较高的灵敏度。与其他比色方法相比，本方法提供了较宽的线性范围，可直接检测血清中的目标物。此外，所述方法及制备获得的芯片可用于对Ⅱ型糖尿病或Ⅱ型糖尿病伴冠心病患者的早期筛查。

技术领域

本发明属于生物分析化学技术领域，涉及一种高选择性、高灵敏度的miRNAs检测方法，具体为智能手机APP结合DSN酶微流体芯片比色检测miRNA-21的方法。

背景技术

目前关于miRNAs分析方法已经有一些报道，包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、表面等离子体共振技术、Northern印迹和微阵列分析等。近年来，生物传感器结合了表面等离子体共振(SPR)、荧光、比色、电化学传感器技术，被认为是一种强大的分析测试工具，许多生物传感技术被开发出来，以提供经济、便捷和灵敏的miRNA检测。虽然这些分析方法已经对miRNA实现了高通量检测，但这些方法仍然有许多局限性，如操作过程复杂、灵敏度低，以及检测方法特异性不足。因此，开发高选择性、高灵敏度的miRNAs检测方法至关重要。通常信号放大过程分为两种，根据常见的生物传感平台使用的材料，可分为酶促信号放大和非酶促信号放大。非酶促信号放大方法具有低成本和高稳定性的特点，例如脂质体。首先，脂质体具有良好的功能化和生物相容性，它可以作为基底或者信号来源，把多种生物受体(例如蛋白质、肽、核酸、抗体)修饰在脂质体上，特异性识别分析物。其次，脂质体是临床上很成熟的纳米级系统，常用于输送胶囊药物、基因、疫苗以及显像剂等。

纳米材料应用于微流控芯片的生物传感器可以显著提高设备的性能。微流体芯片又称芯片上实验室(LOC)或微型全分析系统，具有试剂和样品消耗低、实时检测、分析平台小型化、检测时间短等优点，在生物传感器研究中具有重要意义。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，开发一种灵敏度高、选择性好的miRNAs检测分析方法，本发明提供了智能手机APP结合DSN酶微流体芯片比色检测miRNA-21的方法。

技术方案：智能手机APP结合DSN酶微流体芯片比色检测miRNA-21的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、微流体芯片的制备

取载玻片在去离子水中超声清洗后烘干，将其浸泡于食人鱼溶液中，处理完成后取出用去离子水冲洗、烘干、备用；取3-氨丙基三乙氧基硅烷和无水乙醇按体积比1:50混匀，将备用的载玻片浸泡在其中过夜处理，在载玻片表面修饰上氨基，取出并用无水乙醇冲洗、烘干；

S2、Au纳米颗粒的制备

采用柠檬酸钠还原法制备Au纳米颗粒，将去离子水加入容器内并在油浴锅中加热煮沸，然后依次加入柠檬酸钠和柠檬酸，迅速搅拌反应后添加EDTA和HAuCl₄，待溶液由浅黄色变为灰绿色，最后变为酒红色，冰浴终止反应；

S3、脂质体包裹葡萄糖氧化酶的制备

以DOPC为原料合成脂质体，将其与胆固醇混合后加入氯仿均匀溶解，然后通入氮气并在真空干燥箱中过夜，将葡萄糖氧化酶倒入表面附着有磷脂的容器内，均匀摇晃后自然水合，使得磷脂通过自组装形成脂质体，然后将反应液在脂质体挤压器中反复挤压10次以上，得到大小均匀且包裹有葡萄糖氧化酶的DOPC脂质体；

S4、PDMS芯片检测miRNA过程