[发明专利]靶向STAT3基因的向导RNA、试剂盒、方法及应用

说明书

本申请中公开了靶向STAT3基因的向导RNA、试剂盒、方法及应用。该向导RNA具有如SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列、或与其具有同源性和功能相同的序列。该向导RNA可以靶向识别并引导CRISPR效应蛋白在STAT3基因特异位点处进行剪切，基于该向导RNA的靶向性和内含子剪接的“GT‑AG”规律，将其制备成复合物、试剂盒，可以应用于构建STAT3ΔS亚型的细胞系和模型动物，为STAT3相关疾病如肿瘤、代谢性疾病、炎症性肠病和心血管疾病的药物筛选提供了研究基础。

技术领域

本申请涉及STAT3基因编辑的生物技术领域，尤其涉及靶向STAT3基因的向导RNA、试剂盒、方法及应用。

背景技术

信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator oftranscription，STAT3)是一种具有DNA结合活性的蛋白质家族，STAT家族包括7个已知结构和功能相关的蛋白，分别为STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b和STAT6。其中，STAT3是一个显著的核转录因子，影响超过1000个基因产物的表达。

NCBI数据库显示，STAT3根据基因第21位内含子、第23位内含子的可变剪接而产生四种不同的蛋白亚型：αFL亚型、βFL亚型，αΔS701亚型、βΔS701亚型。进一步地，依据STAT3蛋白是否含有第701丝氨酸可分为即含有第701位丝氨酸(Full-length/FL亚型)的STAT3蛋白和不含Ser701(ΔS亚型)的STAT3蛋白。在人类和小鼠白细胞中，ΔS亚型约占总数的20％，ΔS亚型的恒定存在提示STAT3蛋白的功能由ΔS亚型和FL亚型共同决定。

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一类由多种病因引起的、异常免疫介导的肠道慢性及复发性非特异性炎症性疾病，主要类型包括克罗恩病(Crohn'sdisease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)。IBD最早先发现于西方发达国家，目前病因和发病机制尚未完全明确。在过去的20年中，IBD的发病率和流行率在亚洲、南美、中东、非洲等发展中国家陡升，根据Kaplan和Gilaad G的研究预估，到2025年，中国的IBD患者将达到150万人。

针对IBD的治疗主要包括一般治疗、药物治疗和手术治疗。一般治疗主要针对疾病早期，通过规律作息、饮食干预、应用抗生素等进行治疗；药物治疗主要通过使用水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物减少炎症因子的产生来进行治疗，但长期持续给药的会产生耐药性或较严重的副作用；手术治疗适用于内科治疗无效及并发症(肠梗阻、瘘、脓肿形成、急性穿孔或不能控制的大出血)，且术后复发率较高。因此，深入研究IBD的致病机理和疾病发展进程对于寻找新的有效的药物作用靶点具有重要的理论和实际意义。

STAT3蛋白已被多次报道通过参与免疫细胞的分化成熟而在IBD上发挥重要作用。例如，Zhang M等人发表于Nature的最新研究表明STAT3第108位半胱氨酸的可逆性棕榈酰化循环能够促进T_H17细胞分化和结肠炎；舒红兵院士团队发表于Nature Communications的研究表明TRIM27介导逆转录酶阳性结构的STAT3激活，促进结肠炎和结肠炎相关的癌变。

发明内容

为此，本申请实施例提供了可以靶向识别并引导CRISPR效应蛋白在STAT3基因特异位点处进行剪切的向导RNA，基于该向导RNA的靶向性和内含子剪接的“GT-AG”规律，提供了STAT3基因编辑的向导RNA、试剂盒、方法及应用，能够建立稳定的可复制的STAT3基因的ΔS亚型突变细胞系或基因工程动物，以作为相关开展STAT3相关疾病(例如肿瘤、代谢性疾病、炎症性肠病、心血管疾病)的发病机制的细胞模型和动物模型，具有十分重要的现实意义。为此，本申请实施例至少公开如下技术方案：