[发明专利]融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及N-乙酰神经氨酸的生产方法

说明书

本申请涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及N‑乙酰神经氨酸的生产方法。本申请的融合蛋白酶包括N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺‑2‑差向异构酶、N‑乙酰神经氨酸醛缩酶以及将N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺‑2‑差向异构酶和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶连接的接头(GGGGS)subgt;1‑6/subgt;。本申请利用柔性接头(GGGGS)subgt;1‑6/subgt;将全细胞生物合成N‑乙酰神经氨酸的两种关键酶即AGE和NAL连接，这样可赋予存在蛋白‑蛋白相互作用的AGE和NAL一定摆动范围，利于其形成聚合物，以保证其催化能力与天然游离状态下相当，因此这样的融合蛋白酶可以用于催化合成N‑乙酰神经氨酸，具有很好的应用前景。

技术领域

本申请属于生物工程技术领域，尤其涉及一种融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及N-乙酰神经氨酸的生产方法。

背景技术

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的全细胞生物催化合成主要依赖N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL)的表达作用，过程如下所示：

上述过程可知，AGE酶将底物N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)异构为中间产物N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)，然后NAL酶将底物丙酮酸与中间产物ManNAc缩合成终产物Neu5Ac。Neu5Ac的全细胞生物催化合成具有操作相对简单、成本较低、能确保立体结构、产量较高的特点。

目前报道的AGE和NAL共表达体系中，AGE和NAL分别以不同启动子单独表达，其中AGE酶主要以包涵体的形式表达，包涵体中的蛋白往往错误折叠，并无催化活性，NAL虽然可溶蛋白比例较高，但表达的蛋白总量较少，导致整体催化效率不高。另外，AGE和NAL催化的反应均为可逆反应，并且NAL酶的活性以反方向为主，例如大肠杆菌NAL酶裂解和合成Neu5Ac的活性比约为3：1。因此，优化共表达体系以提高AGE的可溶表达，同时挖掘Neu5Ac合成活性高的NAL酶，是提高Neu5Ac产量的改良方向之一。然而，由于AGE酶的固有特性(包涵体表达)，目前优化AGE可溶表达的效果极为有限，基于AGE和NAL的共表达只能通过增加NAL的拷贝数以提高Neu5Ac产量至127.6±7.61g/L，而且伴随NAL拷贝数的提高，大肠杆菌的负担必然增加，这反过来抑制了Neu5Ac的产量。

发明内容

本申请的目的在于提供一种融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及N-乙酰神经氨酸的生产方法，旨在解决如何构建AGE和NAL的融合蛋白酶以提高Neu5Ac的产量的技术问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种融合蛋白酶，融合蛋白酶包括N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶以及将N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶连接的接头(GGGGS)_1-6。

在一实施例中，融合蛋白酶包括N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶以及将N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶连接的接头(GGGGS)₄。

在一实施例中，N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本申请提供一种融合表达载体，融合表达载体表达本申请的融合表达蛋白酶。

在一实施例中，融合表达载体中表达N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，表达接头(GGGGS)_1-6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：即表达4个GGGGS重复的接头，(GGGGS)₄。