[发明专利]融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及N-乙酰神经氨酸的生产方法

权利要求书

1.一种融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶包括N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶以及将所述N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶和所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶连接的接头(GGGGS)_1-6。

2.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶包括所述N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶、所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶以及将所述N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶和所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶连接的接头(GGGGS)₄。

3.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.一种融合表达载体，其特征在于，所述融合表达载体表达权利要求1-3任一项所述的融合蛋白酶。

5.如权利要求4所述的融合表达载体，其特征在于，所述融合表达载体中表达所述N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，表达所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，表达所述接头(GGGGS)₄的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

6.如权利要求4所述的融合表达载体，其特征在于，所述融合表达载体通过将含有表达所述N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶的核苷酸片段、表达所述接头(GGGGS)_1-6的核苷酸片段和表达所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的核苷酸片段的DNA插入pET-32a(+)质粒的启动子下游得到。

7.一种生产N-乙酰神经氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌含有权利要求4-6任一项所述的融合表达载体。

8.一种N-乙酰神经氨酸的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求7所述的工程菌在无异丙基硫代半乳糖苷诱导剂的条件下诱导培养，然后在含有N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠的反应液中进行全细胞生物催化的产物合成。

9.如权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述在无异丙基硫代半乳糖苷诱导剂的条件下诱导培养的步骤包括：将所述工程菌置于无异丙基硫代半乳糖苷诱导剂的LB液体培养基中，先36～38℃、150～250rpm转速培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后在20～30℃、60～100rpm转速诱导培养22～26小时。

10.如权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述在含有N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠的反应液中进行全细胞生物催化的产物合成的步骤包括：将经诱导培养后的工程菌置于所述反应液中，浓缩菌体密度至OD₆₀₀＝28～32，进行产物合成；其中，所述反应液中N-乙酰葡萄糖胺的浓度为0.5～1.5M，丙酮酸钠的浓度为1.0～1.8M，所述产物合成的温度为25～37℃，转速为150～250rpm，时间为24～48小时。