[发明专利]一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用

说明书

本发明公开了提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b在筛选提神醒脑药物中的应用，涉及药物筛选技术领域，具体为基于行为学指标和上述提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，包括以下步骤：①确定待筛选药物和对照药咖啡因对5日龄斑马鱼幼鱼的最大安全浓度；②基于光照刺激反应下的斑马鱼行为学表现，筛选提神醒脑药物；③基于Real‑time PCR技术，检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平，筛选出提神醒脑药物；④提神醒脑药物的判断标准；本发明的筛选方法，操作流程短，易操作，筛选结果准确高效，将行为学表征和基因表达水平相结合，为以后提神醒脑药物的筛选提供了新的方法。

技术领域

本发明涉及药物筛选技术领域，具体说是一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用，其中筛选是基于行为学指标和提神醒脑标志基因进行。

背景技术

目前药物筛选的方法主要包括分子水平筛选、虚拟筛选、细胞水平筛选和动物模型药物筛选等，其中分子水平筛选筛选有效的药物与目的蛋白结合强，但是在细胞环境中却可能无法发挥作用；虚拟筛选是指通过计算机模拟已知靶点和药物结构之间的相互作用，筛选出可能有效的药物，成本低、速度快，但是筛选出的药物还需要进一步的生物实验进行验证；细胞水平筛选是指用候选药物处理靶细胞，再通过生化实验检验药物对靶细胞的作用，筛选得到的药物虽然能够有效地作用于靶细胞，但是实验流程复杂，对实验环境的要求高，且无法评估药物对整体生物是否有毒副作用，因此也限制了其使用；动物模型药物筛选一般需建立猴等灵长类动物模型、猪和小鼠模型，但是动物疾病模型构建过程是一个巨大的工程，需要系统的理论和复杂的技术手段才能获得有效构建，对动物的生长环境有严格的要求。

斑马鱼由于和人类基因同源性高，各组织器官在受精后24小时即可形成，发育周期短，个体小等优势，为其作为筛选活性药物的动物模型提供了可能。目前对于提神醒脑药物还没有科学、快速有效的筛选方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用，其中筛选是基于行为学指标和提神醒脑标志基因进行。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b在筛选提神醒脑药物中的应用。

本发明还包括基于行为学指标和权利要求1所述的提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，包括以下步骤：

①确定待筛选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全浓度；

②基于光照刺激反应下的斑马鱼行为学表现，筛选提神醒脑药物：

实验当晚24时，将5dpf的斑马鱼幼鱼转移至48孔板中，每孔一条鱼，将上述斑马鱼幼鱼分为对照药物组、空白组和若干实验组，其中对照药物组加入最大安全浓度的咖啡因，空白组加入1mL新鲜养鱼水，每个实验组加入1mL最大安全浓度的一种待筛选药物；每组均设置三个平行试验；

将上述48孔板放入Zebrabox斑马鱼行为分析仪暗箱中，开始检测斑马鱼对光照刺激反应，检测时间为60分钟，每分钟记录一次数据，运用Zeblab软件进行数据处理，计算斑马鱼游动总距离和游动速度，测试不同组别斑马鱼在沉睡时间下的光照刺激反应；

③基于Real-time PCR技术，检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平，筛选出提神醒脑药物：

对提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b设计引物序列：

nr1d4a-RT-F：AGATATCGCATCAGGGTTCC，

nr1d4a-RT-R：CTCGTTCTTCACGCACATCT，

nr1d4b-RT-F：ATCAGGTCATGCTGCTGAAG，