[发明专利]一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用

权利要求书

1.提神醒脑标志基因在筛选提神醒脑药物中的应用，其特征在于：所述提神醒脑标志基因为nr1d4a和nr1d4b；首先通过行为学对斑马鱼进行初筛，然后对提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b设计上下游引物，进行RT-qPCR验证，根据提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达趋势，确定待筛选药物是否具有提神醒脑作用。

2.基于行为学指标和权利要求1所述的提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，其特征在于：包括以下步骤：

①确定待筛选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全浓度；

②基于光照刺激反应下的斑马鱼行为学表现，筛选提神醒脑药物：

实验当晚24时，将5dpf的斑马鱼幼鱼转移至48孔板中，每孔一条鱼，将上述斑马鱼幼鱼分为对照药物组、空白组和若干实验组，其中对照药物组加入最大安全浓度的咖啡因，空白组加入1mL新鲜养鱼水，每个实验组加入1mL最大安全浓度的一种待筛选药物；每组均设置三个平行试验；

将上述48孔板放入Zebrabox斑马鱼行为分析仪暗箱中，开始检测斑马鱼对光照刺激反应，检测时间为60分钟，每分钟记录一次数据，运用Zeblab软件进行数据处理，计算斑马鱼游动总距离和游动速度，测试不同组别斑马鱼在沉睡时间下的光照刺激反应；

③基于Real-time PCR技术，检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平，筛选出提神醒脑药物：

对提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b设计引物序列：

nr1d4a-RT-F：AGATATCGCATCAGGGTTCC，

nr1d4a-RT-R：CTCGTTCTTCACGCACATCT，

nr1d4b-RT-F：ATCAGGTCATGCTGCTGAAG，

nr1d4b-RT-R：GCGTTCCTTAGCATTGAACA，

收集不同处理组行为学记录后的斑马鱼，用养鱼水清洗两到三次，转移至离心管中，高速离心后吸干上层液体，留下底层斑马鱼组织；使用RNA提取试剂盒提取斑马鱼不同实验组的总RNA，利用超微量分光光度计测定RNA浓度，使用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，参照实时荧光定量PCR说明书，以各组反转完成后的cDNA为模板，加入待测引物在qRT-PCR仪器中扩增，每组设置三个平行试验，检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平；

④提神醒脑药物的判断标准：

在沉睡时间下，与空白组相比，提神醒脑药物的游动总距离变大，游动速度增加，反应能力增强；提神醒脑药物和对照药咖啡因的提神醒脑标志基因表达变化相同，均为下调变化。

3.根据权利要求2所述的基于行为学指标和利用提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，其特征在于：①确定待筛选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全浓度的具体步骤为：

将3日龄斑马鱼幼鱼随机分为空白组、对照药物组和若干实验组，每组鱼的数量相同，将斑马鱼幼鱼置于24孔细胞培养板中，每孔8～12条鱼，对24孔细胞培养板投放不同梯度浓度的待筛选药物浸泡3天，每个浓度测试重复3次，对斑马鱼的死亡率进行记录，通过SPSS软件计算确定实验组药物和对照组药物的最大安全浓度。

4.根据权利要求2所述的基于行为学指标和利用提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，其特征在于：待筛选药物为远志提取物、酸枣仁提取物、杜仲雄花提取物、金盏菊提取物和车叶草苷。