[发明专利]驼背海马、三斑海马和克氏海马的荧光PCR检测方法及其引物和探针

说明书

本发明提供了一种针对驼背海马，三斑海马和克氏海马的实时荧光PCR检测方法。基于具有高度物种特异性的驼背海马，三斑海马，克氏海马线粒体细胞色素氧化酶亚基I序列设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以Real‑TimePCR的方法对驼背海马，三斑海马，克氏海马进行物种成分检测和鉴定。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，本方法不仅用于驼背海马，三斑海马，克氏海马三种海马干的准确鉴定，同时可以解决深加工后的海马制品和混合海马制品的真伪鉴别。

技术领域

本发明属于生物技术鉴定领域，特别涉及驼背海马，三斑海马和克氏海马的实时荧光PCR检测方法。

背景技术

海马是珍贵的药材，在中国等亚洲国家深受消费者喜爱。目前海马属内54种海马全部列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附II，同时海马属也被列入我国国家二级重点保护动物名录。驼背海马(Hippocampus camelopardalis)，三斑海马(Hippocampus trimaculatus)和克氏海马(Hippocampus kelloggi)均属于海马属(Hippocampus spp.)海龙鱼目(Syngnathiformes)海龙科(Syngnathidae)动物。受到经济利益驱使，市场上的海马贸易也并未绝迹，近3年本实验室检测鉴定的由海关截获送检的海马样本就高达190多批次。对濒危动植物的精准鉴别是对濒危物种开展保护的最基本手段。

传统的海马鉴别方法主要依赖外部形态特征，但这往往需要鉴定人员具有丰富的经验。此外，市场上销售的海马，不仅仅以海马完整的形态展示，往往还会涉及海马胶囊，海马口服液等形态不完整的海马产品，因此单纯从形态上比较难鉴别。现代分子生物学的鉴别方法可有效克服上述形态学鉴定方法的不足，同时也比物理学的光谱结构分析法，及化学的内含物质结构分析法更加稳定可靠。

CN104017899A公开了“海马的鉴定方法”为基于DNA条形码的特异引物PCR技术。PCR引物由两组FISH的通用引物组成，鉴定方法包括以下步骤：提取海马总DNA，进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增产物进行测序，序列比对后确定海马种类。该方法采用普通PCR方法，该反应时间较长，且反应液必须经过琼脂糖凝胶电泳检测后测序比对才能得到实验结果。电泳需要荧光素染色，大多数的荧光色染料都具有毒性。同时，电泳法检测特异性不太高，引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判，此外特异引物常规PCR扩增的产物进行检测时，样品间可能产生交叉污染，从而引发假阳性问题。因此，需要研究一种灵敏、快速和特异性的鉴定海马的实时荧光PCR方法。

发明内容

针对海马形态学鉴定的局限性，以及普通PCR方法在检测技术中存在的缺点，本发明提供了一种针对驼背海马，三斑海马和克氏海马快速、灵敏的定性检测鉴定方法，可用于海马和海马制品真伪鉴别。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明提供了一种实时荧光PCR实时荧光检测驼背海马、三斑海马和克氏海马的方法，包括以下步骤。

(1)样本DNA提取。取0.2g海马样品，振荡研磨仪中充分研磨成粉状后，使用DNA抽提试剂盒(Promega FF3750)进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在30μL-100μL水中(可根据浓度需要进行调节)。DNA浓度和纯度通过NanoDrop 1000超微量分光光度计在260nm和280nm波长处进行测定。(2)实时荧光PCR扩增检测。引物探针序列如表1所示。实时荧光PCR反应体系如下：10μL Premix Ex Taq(Takara)，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，取上述提取的DNA液2μL，用水补足体积至20μL。应用荧光定量PCR仪lightcycle480(Roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。