[发明专利]一种基于表面增强拉曼光谱检测β-半乳糖苷酶的方法

说明书

本发明开发了一种基于表面增拉曼光谱技术检测血清中β‑半乳糖苷酶的方法。β‑半乳糖苷酶是鉴别衰老细胞的标志酶。其技术方案包括：1)制备纳米金星，2)制备单层、可自组装的纳米金星及标记分子对巯基苯甲酸的二维阵列，3)制备标签，4)将二维阵列与标签通过乳糖组合，形成一个功能化的金板为检测平台。当β‑半乳糖苷酶作用于基底上时，可通过分解乳糖中的β‑半乳糖苷键使二维阵列与标签分离，借助激光拉曼光谱仪收集数据图谱，以标签上PATP受激光照射产生的新信号1437cm^‑1为标志峰，实现对血清β‑半乳糖苷酶含量的超灵敏检测，本方法在检测酶的活力时，在10^‑3‑0.5U·mL^‑1和在0.5‑100U·mL^‑1均可呈线性，并且该检测限可达4.79×10^‑5U·mL^‑1。

技术领域

本发明属于检测的技术领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼技术检测β-半乳糖苷酶的方法。

背景技术

β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)是一种重要的糖苷外切酶，位于膜包裹的溶酶体中，可水解半乳糖和其他有机残留物之间的β-糖苷键，它呈现在细胞外环境中，是识别衰老细胞的标志物，是最早描述的生物标志物之一，是监测衰老过程与研究衰老的重要生物标志物。目前在化妆品功效评价领域，可以建立成纤维细胞模型进行抗衰老评价，通过评估化妆品抑制成纤维细胞产生的β-半乳糖苷酶活力的能力来评价该化妆品的抗衰老能力。而目前常用的方法都具有或多或少的缺陷，比如：误差大、染色时间长、精确度不高以及成本高等问题，同时目前关于β-半乳糖苷酶的国家标准和团体标准尚未被制定出来。因此，开发检测β-半乳糖苷酶的方法具有重要意义。

目前有许多检测方法，如比色法、荧光法、近红外荧光法(NIRF)，每种方法都有其优势和劣势。比色法简单，然而，该方法存在精度低、染色时间长、检测灵敏度低等问题。荧光法的检测容易受到生物体自身荧光的影响，难以用于生物体成像的缺陷；近红外区域的荧光成像可以有效减少背景干扰，表现出较好的成像质量，但由于其有机荧光染料的抗光漂白能力低，成像发光时间短，水溶性差，因此应用受到限制。表面增强拉曼散射(SERS)是一种有用的分析技术，用于检测微量的生化分析物。由于贵金属纳米结构具有很强的质子增强作用，单分子识别已经被SERS证明。通过将待测物分子吸附在粗糙的纳米金属材料表面，可将拉曼信号增强至106～1015倍。与传统检测手段，它具有灵敏、快速、良好的重现性等优点。

电磁增强作为主要引起拉曼信号增强，其效果与金属基底的类型和状态以及表面结构有关。金纳米星(Au NSs)是具有刺状结构的多分支纳米粒子，由于其出色的SERS增强作用，它是生物医学应用中的一颗新星。二维(2D)基底的构建作为一种新的混合纳米结构，与单个纳米粒子相比，具有更好的均匀性、可重复性和稳定性。此外，基于二维结构形成的夹层结构保持了良好的均匀性和稳定性，还可以产生更多的热点，进一步提高SERS的增强效果。

专利快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用(CN113527389A)具体公开了一种荧光探针可以检测β-半乳糖苷酶的方法。该方法制备不易且其线性范围仅为0-0.03U·mL-1。

发明内容

为了解决上述检测方法的不足，本实验旨在构建一种更经济、更快速、更低检测限的检测SA-β-gal的方法。本方法提出了一个基于SERS的平台，即由Au NSs和玻璃板构建的Au NSs二维阵列，首先，Au NSs的多分枝结构可以产生更强的信号，提高检测的灵敏度，同时这种二维阵列的构建可以有效地解决精度低、均匀性不强地问题；该二维阵列用PMBA修饰后附着在β -lactose上，并与PMBA和PATP修饰的Au NSs连接，从而形成三明治结构，此外，标签与基底相连，产生更多的热点，进一步提高SERS强度，极大地提高了检测的灵敏度。该方法构建的检测基底所使用的试剂，均为常见、价廉的化学试剂，降低了检测成本，且无需长时间染色，仅需与受试样品浸泡1h 即可测试，易于操作，解决了目前方法或耗时长或操作难度高的问题，是一种更经济、更快速、更方便的检测方法。