[发明专利]胃癌早期筛查的DNA甲基化标志物组合及试剂盒

说明书

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，涉及一种用于胃癌早期筛查的DNA甲基化标志物组合及试剂盒。包括KLRK1基因chr12_10541790位点、TRDJ3基因chr14_22927264位点和chr14_22926867位点、TRDC基因chr14_22931150位点的甲基化检测引物对及探针。本发明提供了一种用于胃癌早期筛查的试剂盒，能够对疑似胃癌病人的外周血单个核细胞基因组DNA进行检测以筛查胃癌，检测灵敏度能够达到81.65％，特异性能达到81.35％。本发明提供的检测方法操作简便、快速，安全无创，仅需要3 mL血也便可完成检测，在减少患者痛苦的基础上能够得到准确的检测结果，具有很高的临床应用价值。

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，涉及一种用于胃癌早期筛查的DNA甲基化标志物组合及试剂盒。

背景技术

胃癌（gastric cancer）是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一，也是全球第五常见的恶性肿瘤，其病死率在恶性肿瘤中排第四位，严重威胁人类的生命健康。胃癌的发生是一个多因素共同参与的复杂过程，其发病主要与幽门螺杆菌感染、饮食、生活方式及遗传等因素密切相关，尤其易发生在老年人之中，且男性发病率显著高于女性。胃癌的早期发现和治疗对于改善患者的预后至关重要，早期胃癌的5年生存率可以达到95%以上。然而，由于胃癌起病隐匿，早期通常没有临床症状或仅表现出非特异性临床症状，因此在患者初诊时可能已经达到晚期，这使得胃癌的早期诊断和治疗受到极大的限制，总体预后不良。目前常用来诊断胃癌的几种诊断方法在临床应用方面存在着不同程度的局限性：胃镜检查价格昂贵、创伤性大、病人依从性差；血清肿瘤标志物（如胃蛋白酶原、幽门螺杆菌抗体、CEA、CA19-9等）检测及灵敏度低、特异性差；CT检查对早期诊断有限，对细小肿块较易出现漏诊。因此，寻找非侵入性、高灵敏度和高特异度的新型标志物用于无创性胃癌筛查早期诊断，是目前临床上亟需解决的问题。

表观遗传学（epigenetics）是一门新兴学科，其定义为不涉及基因组的碱基序列改变的情况下，基因的表达发生改变。DNA甲基化是一个重要的表观遗传因素，指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究证实，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，启动子区域的异常甲基化可导致癌基因的激活或抑癌基因的沉默。由于DNA甲基化往往发生在癌症发生过程的早期，所以在肿瘤诊断中应用越来越广泛，可作为胃癌早期筛查的可靠途径。

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），即外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（T/B）、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其他少量细胞类型，其中淋巴细胞约占70%~90%。已有研究发现，在肿瘤发生发展中，DNA甲基化通过调控免疫细胞功能，如介导细胞分化、成熟、浸润等，参与机体对肿瘤的免疫应答，PBMC的甲基化研究能够为肿瘤的早期无创性诊断和免疫治疗监测提供新的方法。

发明内容

本发明针对传统胃癌诊断中存在的具有侵入性、费时费力、准确性低等问题提出一种新型的用于胃癌早期筛查的DNA甲基化标志物组合及试剂盒。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

本发明提供一种用于胃癌早期筛查的甲基化位点组合，所述组合包括KLRK1基因启动子区的chr12_10541790、TRDJ3基因启动子区的chr14_22927264和chr14_22926867、TRDC基因启动子区的chr14_22931150。

本发明还提供了用于胃癌早期筛查的甲基化检测引物及探针组合，所述组合包括用于检测所述位点甲基化水平的特异性引物和探针。

所述KLRK1基因启动子区chr12_10541790的甲基化检测引物对序列为5'-GATAATAATATATTTAGTTTTTTGTTTATAGTCG-3'和5'-AACTAAATTATTACCAAATAAAATAAACAACT-3'；