[发明专利]重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法及其提高p37k蛋白酶性能的方法

说明书

本发明公开了重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法及其提高p37k蛋白性能的方法，本发明通过Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统表达得到约40kD的重组蛋白，然后激活后获得分子量约为25kDa的p37k蛋白酶，25kDa的p37k蛋白酶具有明胶酶活性，但是重组表达的p37k蛋白酶的对热敏感，研究发现在p37k蛋白酶加入中肠提取物和金属离子能够提高重组表达的p37k蛋白酶的热稳定性，并且，加入E64能够提高重组表达的p37k明胶水解活性。因此，中肠提取物和金属离子能够作为p37k蛋白酶的热稳定性保护剂，E64能够作为p37k明胶水解活性的增强剂，为进一步拓展p37k蛋白酶条件提供了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法，还涉及提高p37k蛋白酶性能的方法。

背景技术

近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，使生物催化剂在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。酶作为一种生物催化剂，已发现4000种，其中蛋白酶作为酶的主要组成部分占全球工业酶总销量的70％。目前，蛋白酶的生产主要来源于微生物发酵。微生物蛋白酶的大规模生产存在一个缺点，即需要密集过滤才能获得无微生物制剂，成本高。此外，蛋白酶作为生物大分子对外界环境(如高温、极端pH等)十分敏感，大大增加了蛋白酶的生产、运输和保存成本。因此，获得性质稳定的蛋白酶对工业生产至关重要。昆虫肠道作为一个重要的消化器官，含有多种蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、组织蛋白酶、羧肽酶和丝氨酸蛋白酶等，使其成为天然的蛋白酶资源库。另外，肠道的碱性微环境使其具有分离工业重要特性蛋白酶的潜能。

昆虫体内蛋白酶因其独特的特性得到了越来越多的关注。在斜纹叶蛾和美洲大蠊肠道中的碱性蛋白酶表现出热稳定性，最适温度为50～70℃，东方黄蜂的胰蛋白酶样蛋白酶在60℃时活性最大。2017年Mani Kannan等人在家蚕中肠内鉴定到一种胰蛋白酶型的丝氨酸蛋白酶(称为：p37k蛋白酶)。p37k蛋白酶对明胶具有底物特异性，最佳pH值和温度分别为pH 9.0和60℃。肠道中的p37k蛋白酶对表面活性剂、氧化剂和商业洗涤剂具有显著的稳定性和相容性，将其加入1％的洗涤剂中，能够使带血的纱布变为完全脱色布，具有明显的血凝块溶解的活性，表明家蚕肠道p37k蛋白酶可作为洗涤工业的助剂。蛋白酶的热稳定性是阻碍蛋白酶适用场景的重要因素，p37k蛋白酶作为一种具有工业生产价值的蛋白酶，其在体外重组表达和如何提高热稳定性和活性是值得探究的问题。因此，解析中肠中p37k蛋白酶热稳定性机制、增强其活力是提高重组p37k效率的关键问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法；本发明的目的之二在于提供提高p37k蛋白酶性能的方法，其中性能包括热稳定性和活性；本发明的目的之三在于提供中肠提取物或金属离子溶液在制备提高p37k蛋白酶热稳定性的保护剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法，将p37k基因通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达，纯化后在0～10℃下激活处理，获得具有明胶酶活性p37k蛋白酶。

本发明优选的，所述p37k基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、提高p37k蛋白酶性能的方法，所述性能为稳定性或活性；提高稳定性的方法为将重组p37k蛋白酶激活处理后与中肠提取物或金属离子溶液混合，得到热稳定性提高的p37k蛋白酶；提高活性的方法为将重组p37k蛋白酶激活处理后与E64蛋白酶抑制剂共混。

所述E64酶制剂为半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

本发明优选的，所述激活处理是在温度为0～10℃下激活处理至少120小时。

本发明优选的，所述中肠提取物为取家蚕中肠组织，去除内容物后匀浆得到的匀浆液。