[发明专利]一种基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法及应用。本发明联合RPA等温扩增技术与CRISPR/Cas检测体系，通过芯片将包含有RPA与CRISPR/Cas的反应体系分布至数以万计的微室，然后将终点荧光信号的检测转化为分子计数，即可实现一步法对肿瘤相关基因低频突变的定量检测。本发明无需依赖标曲，即可解决目前基于CRISPR/Cas核酸检测技术中无法对肿瘤相关基因变异进行准确定量的问题，并且与目前检测突变频率的金标准方法，如二代测序、数字PCR相比，大大缩短了反应时间，无需PCR仪、测序仪等昂贵仪器，操作简便。本发明可替代传统的单核苷酸变异定量检测方法，尤其适用于设备简陋的基层实验室，为肿瘤患者的用药监测及预后提供更为快速简便的检测。

技术领域

本发明涉及基因突变频率检测技术领域，特别涉及一种基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法及应用。

背景技术

遗传变异在癌症患者的基因组中普遍存在，主要包括单核苷酸变异(SNV)、插入、缺失和拷贝数变异，其中SNV所占比例最大。表皮生长因子受体(EGFR)、KRAS和BRAF的单核苷酸变异已被证明与非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌和甲状腺癌密切相关。因此，高度灵敏的基因变异检测为癌症患者的早期诊断和靶向治疗提供了一个新的方向。此外，基因突变频率的精确定量对于肿瘤的预后和监测也至关重要。

然而，许多肿瘤相关的核苷酸变异实际上处于非常低的水平，特别是在循环肿瘤DNA(ctDNA)中。由于罕见的核苷酸变异频率低，且检测背景复杂，因此检测十分具有挑战性。目前检测基因突变的常用方法最主要Sanger测序、二代测序(NGS)和数字PCR(dPCR)，但这些方法耗时、费力，并且需依赖于专业和昂贵的仪器。

规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)是细菌和古细菌防御机制的起源，通常依靠Cas内切酶和引导RNA来切割特定的核酸序列。CRISPR系统第二类中的一些Cas蛋白，如Cas12、Cas13和Cas14，已被证明同时具有顺式切割和反式切割活性。一旦Cas12a和特定crRNA的复合物识别并切割DNA靶点，反式切割活性就会被触发，导致单链DNA(ssDNA)的无差别切割。基于这一特性，在CRISPR反应中引入荧光淬灭基团标记的ssDNA可以产生荧光信号，从而可以对目标核酸进行可视化检测。重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification,RPA)是目前常用的一种等温扩增方法，它不依赖PCR仪，无需变温操作，在37℃-42℃的条件下就能实现恒温核酸扩增，且扩增效率高，时间更短。目前开发了许多与等温扩增技术结合的CRISPR/Cas核酸即时检测(point-of-care testing,POCT)平台，实现了病原体核酸和肿瘤相关基因快速灵敏的检测，其中最常用的是RPA。

虽然已有将CRISPR与数字化策略相结合，实现了病原体核酸的绝对定量。但目前使用CRISPR/Cas系统检测肿瘤相关基因突变仅实现了定性检测，无法准确定量突变频率，尤其是低频突变。因此发明一种特异性强、灵敏度高，又易于实施的基因突变频率检测方法十分重要。发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法及应用。

本发明的技术方案：一种基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，包括如下步骤：

步骤1、制备野生型检测反应体系和突变型检测反应体系；

步骤2、在野生型检测反应体系和突变型检测反应体系中均加入等量的待测核酸，然后加入镁离子盐，分别得到野生型待反应混合溶液和突变型待反应混合溶液；

步骤3、将野生型待反应混合溶液和突变型待反应混合溶液分别进行离散化，然后通过数字芯片上样器加载至芯片中，用芯片配套的浸液封片，在37-43℃下反应；

步骤4、反应结束后，取出芯片使用荧光显微镜分别采用FAM荧光通道和ROX荧光通道采集荧光图像；