[发明专利]一种基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1、制备野生型检测反应体系和突变型检测反应体系；

步骤2、在野生型检测反应体系和突变型检测反应体系中均加入等量的待测核酸，然后加入镁离子盐，分别得到野生型待反应混合溶液和突变型待反应混合溶液；

步骤3、将野生型待反应混合溶液和突变型待反应混合溶液分别进行离散化，然后通过数字芯片上样器加载至芯片中，用芯片配套的浸液封片，在37-43℃下反应；

步骤4、反应结束后，取出芯片使用荧光显微镜分别采用FAM荧光通道和ROX荧光通道采集荧光图像；

步骤5、对FAM荧光通道和ROX荧光通道采集的荧光图像进行量化分析，分别得到野生型荧光强度散点图和突变型荧光强度散点图，然后以阈值进行区分，获得野生型荧光强度散点图中的阴性微室数和阳性微室数，以及获得突变型荧光强度散点图中的阴性微室数和阳性微室数；

步骤6、根据泊松分布分别计算出野生型拷贝数浓度和突变型拷贝数浓度，再由野生型拷贝数浓度和突变型拷贝数浓度确定突变频率。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，其特征在于：所述野生型检测反应体系包括1×RPA缓冲液、1管RPA冻干酶粉、480nM的RPA正反向引物、400nM的LbaCas12a、400nM的野生型crRNA，800nM的荧光猝灭基团标记的单链DNA、1×ROX、14mM的醋酸镁和10mM的DTT。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，其特征在于：所述突变型检测反应体系包括1×RPA缓冲液、1管RPA冻干酶粉、480nM的RPA正反向引物、400nM的LbaCas12a、400nM的突变型crRNA，800nM的荧光猝灭基团标记的单链DNA、1×ROX、14mM的醋酸镁和10mM的DTT。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，其特征在于：步骤3中，反应温度为42℃，反应时间为60min。

5.根据权利要求1所述的基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，其特征在于：所述量化分析是使用ImageJ将ROX荧光通道采集的荧光图像转换为8-bit格式，再调整阈值，确保勾勒出每个微室的轮廓，然后根据ImageJ中的颗粒计数获取需要分析的区域，根据ROX荧光通道采集的荧光图像得到的需要分析的区域，测量FAM荧光通道对应荧光图像中需要分析的区域的荧光强度，从而绘制得到荧光强度散点图。

6.根据权利要求5所述的基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，其特征在于：所述野生型拷贝数浓度的计算如下：

式中：C₁表示野生型拷贝数浓度，PPD₁表示野生型荧光强度散点图中阳性微室占有效微室的比例，有效微室为阴性微室数和阳性微室数之和，V₁表示芯片单个微室的体积；

所述突变型拷贝数浓度的计算如下：

式中：C₁表示突变型拷贝数浓度，PPD₂表示突变型荧光强度散点图中阳性微室占有效微室的比例，有效微室为阴性微室数和阳性微室数之和，V₂表示芯片单个微室的体积。

7.根据权利要求6所述的基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法，其特征在于：所述突变频率的计算如下：

8.根据权利要求1-7任一所述的基于CRISPR的基因突变频率数字化定量检测方法在基因突变检测中的应用。