[发明专利]一种快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法

权利要求书

1.一种快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.制备菌株储备液；将冻干的营养缺陷型菌株接种到乳酸菌肉汤培养基上，33-39℃培养16-24 h；再转种3代增强活力；将活化后的菌液以8000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL无菌水，混匀；重复洗脱3次，确保无残留培养基；加入含甘油的维生素B12测定用培养基，混匀制成菌株储备液，分装到菌株保存管中，- 70℃冻存备用；

S2.制备测定用平板；配制一定量的维生素B12测定用培养基，加入琼脂粉后，121℃灭菌5min，冷却至50-60℃，加入适量的菌株储备液，使培养基中菌浓度在设定的OD₆₀₀值；充分混匀后，分装于无菌培养皿内；轻摇平板使菌液均匀平铺，待其凝固后制成测定用平板，2-4℃保存备用，试验时按量取用；

S3.制备标准溶液；

S4.制备样液；

S5.制备标准曲线及维生素B12含量的测定；

制备标准曲线：将无菌牛津杯放入维生素B12测定用平板中，移取标准曲线溶液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于33-39℃恒温培养箱中培养16-24h；测量各溶液的菌株生长圈的直径；以维生素B12标准品浓度的对数值为横坐标，生长圈直径为纵坐标，绘制标准曲线；

维生素B12含量的测定：移取样液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于33-39℃恒温培养箱中培养16-24h；测量各溶液的菌株生长圈的直径，然后根据标准曲线计算样品中维生素B12的含量。

2.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述营养缺陷型菌株为莱士曼氏乳酸杆菌。

3.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S1中，加入含10-30%甘油的维生素B12测定用培养基。

4.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述维生素B12测定用培养基中琼脂的浓度为0.5%-2%。

5.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S2中，使培养基中菌浓度OD₆₀₀值为0.015-0.035。

6.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S2中，分装于无菌培养皿内，每皿10-15mL。

7.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S3中，包括精确称取维生素B12标准品，用蒸馏水稀释成1ng/mL的标准工作液，121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；使用无菌水稀释成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/L的标准溶液，备用。

8.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S4中，包括取待测样品1g，加入40mL蒸馏水，充分混匀；121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；根据样品中维生素B12的浓度稀释至标准曲线范围内，备用。

9.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S5中，牛津杯的加样量为100-300uL。

10.根据权利要求1所述的快速测定食品和乳品中维生素B12的检测方法，其特征在于，步骤S5中，标准曲线的制备和维生素B12含量的测定采用同一批次步骤S2中制备的平板，并同时进行检测。