[发明专利]高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌株及5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法

说明书

本发明属于微生物和生物技术领域，具体涉及一种高产5‑氨基乙酰丙酸的基因工程菌，以及利用该菌生产5‑氨基乙酰丙酸的方法。本发明通过一系列的代谢工程改造，获得了高产5‑ALA的重组基因工程菌。其中，在一个最优选的实例中，所得到的重组菌株的5‑ALA的产量达到了30.65 g/L，生产强度和转化率分别为1.02 g/L和0.53 mol/mol，可大幅降低5‑ALA的生产成本，能够满足工业化应用的需要，具有很好的应用潜能。

技术领域

本发明属于微生物和生物技术领域，具体涉及一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌，以及利用该菌株生产5-氨基乙酰丙酸的方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid，5-ALA) 是生物体合成血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物的前体，四吡咯化合物则是细胞色素、血红蛋白、叶绿体蛋白等的重要组成部分，在生命活动中发挥着重要作用。因具有可降解和无毒无残留等特点，5-ALA在医药、农业、畜牧业、日用化学品等领域应用前景广阔，是一种重要的高附加值生物基化学品。5-ALA作为新一代光动力学药物可用于癌症治疗、肿瘤诊断和皮肤病的治疗等；作为植物生长调节剂5-ALA可以大幅促进花卉、作物和蔬菜的生长，提高作物、果品、蔬菜的品质；作为动物饲料添加剂5-ALA可以增强动物的新陈代谢和免疫力。近年来，5-ALA还作为主要添加成分用于化妆品以及保健食品的开发，相关产品已上市销售。

然而，目前5-ALA主要通过化学合成方法制备，存在反应步骤多、转化率低、生产成本高、能耗物耗高、制备过程中使用有毒原料、环境污染严重和价格居高不下等缺点。

随着社会和科学技术的发展，以高效清洁的生物发酵法代替化学合成法生产5-ALA成为人们研究的重点。目前利用微生物生产5-ALA的方法主要有两类：一是对光合细菌进行诱变育种，选育高产5-ALA的突变株并在特定培养基上培养，积累较高浓度的5-ALA，但该方法发酵周期较长，条件控制复杂，底物和抑制剂的添加也增加了生产成本。二是利用代谢工程技术改造微生物的代谢途径，通过强化5-ALA的合成使5-ALA的过量积累。微生物合成5-ALA的菌株主要为大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。然而，目前微生物生产5-ALA的产能较低，如大肠杆菌目前报道的最高产量为15.6 g/L(Yu, T.-H., Tan, S.-I., Yi, Y.-C., Xue,C., Ting, W.-W., Chang, J.-J., Ng, I.S., 2022. New insight into the codonusage and medium optimization toward stable and high-level 5-aminolevulinicacid production inEscherichia coli. Biochem. Eng. J. 177, 108259.)；谷氨酸棒杆菌最高产量为25.05 g/L（生产强度0.52 g/L/h，转化率16.79%）（王丽君等. 代谢改造重组谷氨酸棒杆菌C4途径高效合成5-氨基乙酰丙酸. 生物工程学报，2021, 37(12)），并且发酵周期较长、糖酸转化率较低，难以满足工业化生产的要求。

综上所述，本领域急需构建更高效的工程菌株，以便提高5-ALA的产量，进一步降低生产成本。

发明内容

针对上述需求，本发明通过一系列的代谢工程改造，获得高产5-ALA的重组大肠杆菌。

本发明的目的是提供一种构建5-ALA高产菌株的方法，以及利用该方法构建的5-ALA高产菌株，利用该菌株生产5-ALA的方法。

第一方面，提供了一种构建5-ALA高产菌株的方法，其特征在于，增强菌株中5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性，且增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，且弱化琥珀酰辅酶A合成酶的活性，且弱化5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性，且弱化异柠檬酸裂解酶的活性，且增强泛酸激酶的活性，且增强5-ALA转运蛋白的活性，且增强5-ALA氧化损伤修复系统相关蛋白的活性。