[发明专利]一种逆行跨多级突触的标记方法及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，提供了一种逆行跨多级突触的标记方法及其应用。逆行跨多级突触标记的方法包括以下步骤：S1：构建表达N2cG的腺相关病毒核心质粒，并利用所述腺相关病毒核心质粒制备可跨血脑屏障的重组PHP.eB血清型腺相关病毒；S2：将所述重组PHP.eB型腺相关病毒经尾静脉注射到小鼠活体；S3：注射3周后，再注射CVS‑N2c‑ΔG‑EGFP病毒，其中，所述腺相关病毒核心质粒的序列如SEQ ID NO：3所示。本发明提供的逆行跨多级突触标记的方法可有效标记全脑多级输入网络，在特定脑区的多级神经输入结构与功能解析、疾病模型建立和基因治疗评估等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种逆行跨多级突触的标记方法及其应用。

背景技术

神经网络是我们理解大脑工作机制的物质基础，神经网络结构连接极其复杂，其异常往往导致各种脑疾病的发生，如帕金森、自闭症、阿尔兹海默症等，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，高效逆行跨多突触标记神经输入网络的工具病毒载体在神经环路结构与功能解析中扮演重要角色。目前报道的能够逆行跨多级突触标记的野生型伪狂犬病毒(PRV)和野生型狂犬病毒(RV)能够用来研究特定脑区的多级神经输入网络，但野生型PRV表达弱，毒性大，且在非人灵长类动物上没有感染活性，无法满足非人灵长类动物的神经网络解析。野生型RV表达强，但是毒性大，传播不可控，危险性高。为了安全起见，复制相关的外膜糖蛋白(RVG)缺失的RV病毒被开发，通过在特定脑区补偿RVG蛋白能够辅助RV进行逆行跨单级突触标记，但不能用于全脑高效逆行跨多级突触标记。

因此，本发明通过可跨血脑屏障的PHP.eB血清型腺相关病毒经尾静脉注射全脑补偿N2cG蛋白，辅助N2cG缺失的狂犬病毒株CVS-N2c-ΔG实现高效逆行跨多级突触标记全脑上游多级神经输入网络。

发明内容

本发明提供了一种逆行跨多级突触的标记方法，通过全脑补偿N2cG蛋白辅助N2cG缺失的狂犬病毒株CVS-N2c-ΔG实现高效逆行跨多突触标记全脑上游多级神经输入网络。

所述逆行跨多级突触的标记方法包括以下步骤：

S1：构建表达N2cG的腺相关病毒核心质粒，并利用所述腺相关病毒核心质粒制备重组PHP.eB型腺相关病毒；

S2：将所述重组PHP.eB型腺相关病毒经尾静脉注射到C57BL/6J小鼠活体，全脑补偿N2cG蛋白；

S3：注射3周后，在特定脑区定位注射CVS-N2c-ΔG-EGFP病毒，

其中，所述腺相关病毒核心质粒的序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步地，S1中构建表达N2cG的腺相关病毒核心质粒包括以下步骤：

S11：以N2cG基因序列为模板，序列如SEQ ID NO.1所示的N2cG-F为正向引物，序列如SEQ ID NO.2所示的N2cG-R为反向引物，进行PCR扩增，回收扩增出的N2cG片段；

S12：使用SalI和EcoRI限制性内切酶分别酶切pAAV-EF1α-DIO-H2B-GFP-P2A-N2c(G)载体和所述N2cG片段，然后采用T4连接酶将所述N2cG片段插入到酶切后的骨架质粒中，获得连接产物；

S13：将所述连接产物转化感受态Stbl3，菌落PCR鉴定为阳性的克隆接种到LB液体培养基中进行培养并抽提质粒进行测序。

进一步地，S11中PCR的扩增体系体积为50μL，包括5×Reaction Buffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，10μM正向引物2.5μL，10μM反向引物2.5μL，模板DNA0.5μL，DNAPolymerase0.5μL，ddH2O 33μL。