[发明专利]一种逆行跨多级突触的标记方法及其应用

权利要求书

1.一种逆行跨多级突触的标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：构建表达N2cG的腺相关病毒核心质粒，并利用所述腺相关病毒核心质粒制备重组PHP.eB型腺相关病毒；

S2：将所述重组PHP.eB型腺相关病毒经尾静脉注射到C57BL/6J小鼠活体，全脑补偿N2cG蛋白；

S3：注射3周后，在特定脑区定位注射CVS-N2c-ΔG-EGFP病毒，

其中，所述腺相关病毒核心质粒的序列如SEQ ID NO：3所示。

2.如权利要求1所述的逆行跨多级突触的标记方法，其特征在于，S1中构建表达N2cG的腺相关病毒核心质粒包括以下步骤：

S11：以N2cG基因序列为模板，序列如SEQ ID NO.1所示的N2cG-F为正向引物，序列如SEQ ID NO.2所示的N2cG-R为反向引物，进行PCR扩增，回收扩增出的N2cG片段；

S12：使用SalI和EcoRI限制性内切酶分别酶切pAAV-EF1α-DIO-H2B-GFP-P2A-N2c(G)载体和所述N2cG片段，然后采用T4连接酶将所述N2cG片段插入到酶切后的骨架质粒中，获得连接产物；

S13：将所述连接产物转化感受态Stbl3，菌落PCR鉴定为阳性的克隆接种到LB液体培养基中进行培养并抽提质粒进行测序。

3.如权利要求2所述的逆行跨多级突触的标记方法，其特征在于，S11中PCR的扩增体系体积为50μL，包括5×Reaction Buffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，10μM正向引物2.5μL，10μM反向引物2.5μL，模板DNA 0.5μL，DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 33μL。

4.如权利要求2所述的逆行跨多级突触的标记方法，其特征在于，S11中PCR扩增方法为：98℃3min，98℃20s，60℃20s，72℃2min，72℃10min，16℃30min，30个循。

5.如权利要求1所述的逆行跨多级突触的标记方法，其特征在于，S1中利用所述腺相关病毒核心质粒制备重组PHP.eB型腺相关病毒包括以下步骤：

S14：将所述腺相关病毒核心质粒与PHP.eB血清型AAV衣壳质粒pUCmini-iCAP-PHP.eB、腺病毒元件辅助质粒pAd-Helper共转染HEK-293T细胞，转染72小时后分别收集上清和沉淀。

6.如权利要求5所述的逆行跨多级突触的标记方法，其特征在于，S14中所述腺相关病毒核心质粒与PHP.eB血清型AAV衣壳质粒pUCmini-iCAP-PHP.eB、腺病毒元件辅助质粒pAd-Helper按质粒分子数1:1:1共转染HEK-293T细胞。

7.如权利要求5所述的逆行跨多级突触的标记方法，其特征在于，S14中收集上清和沉淀包括以下步骤：

将共转染后72小时的HEK-293T细胞沉淀用裂解液重悬，加入Benzonase核酸酶37℃消化1小时，取上清液，将所述上清液与HEK-293T细胞培养上清液合并，加入PEG8000和NaCl溶液混匀，离心弃上清，用PBS缓冲液溶解获得病毒上清浓缩液；

于离心管中依次加入15％、25％、40％、58％的碘克沙醇溶液配制密度梯度，后加入10mL所述病毒浓缩液，最后用所述PBS缓冲液补满离心管并封口，置于离心机离心，离心结束后用注射器吸取以回收40％碘克沙醇分离层的溶液，将吸取的所述40％碘克沙醇分离溶液用透析袋在所述PBS缓冲液里中透析，将透析后的病毒液用0.22μm的滤膜过滤除菌后加入到超滤管中，离心脱盐浓缩至体积160μL左右。

8.如权利要求1-7所述的任一种逆行跨多级突触的标记方法在标记全脑多级输入网络中的应用。