[发明专利]一种基于uPA的GFD结构域构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

说明书

本发明提供了一种基于uPA的生长因子样结构域(GFD)构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用。具体地，本发明提供了一种基于GFD改造的嵌合抗原受体(CAR)，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地靶向GFD结合蛋白(包括uPAR)。本发明的CAR免疫细胞具有较强的特异性和较适宜的靶点亲和力，因此对靶细胞的杀伤能力较强且安全性高。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗生物医药技术领域，涉及特异性嵌合抗原受体免疫细胞，具体涉及一种特异性靶向GFD结合蛋白的嵌合抗原受体、其修饰的免疫应答细胞、及其制备方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)是体外人为地改造T细胞，使T细胞具有靶向性，然后再将其回输至患者体内，特异性杀伤肿瘤细胞的一种免疫疗法。在CAR-T疗法中，CAR工程改造的T细胞将抗体的特异性与T细胞的归巢和杀伤能力结合在一起，特异性发挥效应。此外，也可将其他特征修饰(如迁移，体内稳态增殖，抑制抗性等)嵌入到CAR-T细胞中，使其能更好地发挥效应。

尿激酶型纤溶酶原激活受体(uPAR)是一种GPI锚定的细胞膜受体，由三个同源结构域(DI，DII，DIII)组成，其主要功能是激活尿激酶(uPA)蛋白水解活性，调节细胞外基质(ECM)组分降解。uPA酶原和uPA都能结合uPAR，uPAR的一部分在与配体结合时被蛋白酶水解切割，产生可溶性uPAR(suPAR)。有大量文献证明了uPAR在大多数肿瘤进展中的重要性，在大多数的肿瘤细胞和肿瘤基质中过表达，包括乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，卵巢癌，肺癌和胶质瘤等实体瘤，以及急性白血病和骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤。然而正常组织仅在胸骨上皮中、单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞的亚群检测到低uPAR表达。研究表明，(1)uPAR表达升高与不同类型癌症患者的不良结局(侵袭、转移和复发)有关；(2)uPAR与肿瘤代谢密切相关；(3)uPAR表达与非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌(CRC)患者的RAS基因突变相关；(4)uPAR是调节肿瘤细胞休眠和增殖之间转变的关键参与者；(5)uPAR与肿瘤细胞的多药耐药性(MDR)有关；(6)uPAR与肿瘤血管生成有关。

衰老(aging)是受遗传和环境因素共同影响的复杂过程，与永久性、渐进性的生理细胞衰退密切相关，是导致人口老龄化日渐严重的原因之一。衰老能够显著提高机体的患病率，即衰老相关疾病，如糖尿病、阿尔茨海默症、心血管疾病及神经退行性疾病等。个体衰老与衰老细胞既有联系，但又完全不同。衰老细胞是细胞处于稳定的细胞周期阻滞和分泌调节组织微环境的相关细胞因子。在生理上，衰老细胞是一种抑制肿瘤的机制，可以阻止癌前细胞的扩张，并在伤口愈合反应中发挥有益的作用。随着个体衰老，组织内会积累衰老细胞。衰老细胞在老年个体组织中的比例很少，但衰老细胞的积累会促进个体衰老及产生炎症环境、导致慢性组织损伤，如肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎等疾病。在老年个体中消除衰老细胞可以改善这些病理症状，甚至促进长寿。已有研究证实，uPAR是细胞衰老的重要表面标志物，并且衰老细胞可分泌可溶性uPAR(suPAR)、作为衰老相关分泌表型(SASP)的一部分。

鉴于uPAR在肿瘤和衰老发生发展中的重要作用，已经有大量的研究探究uPAR在肿瘤和衰老，以及衰老相关疾病的诊断、预后方面的作用；以及将uPAR作为恶性肿瘤、衰老和衰老相关疾病的治疗靶标，探究靶向uPAR在相关治疗中的作用。

uPA蛋白含有N端的ATF结构域(Amino-Terminal Fragment)和C端的催化结构域，ATF结构域又可分为两个小的结构单元：GFD(Growth Factor-like Domain)和Kringle结构域。虽然GFD结构域是uPA结合uPAR所必需的，但已有研究多采用ATF来研究uPA与uPAR的结合，以及用ATF结构域和EGF(epidermal growth factor)构建双特异性抗体靶向EGFR和uPAR、用ATF结构域构建靶向uPAR的CAR-T。ATF中的Kringle结构域可与其他蛋白如整合素(integrins)等结合，可能导致T细胞杀死整合素阳性的细胞，产生副作用。更小的GFD结构域是否能用于构建CAR-T并不清楚。