[发明专利]一种分子桥介导的赭曲霉毒素A检测方法及试剂盒

说明书

赭曲霉毒素A(OTA)在极低剂量下可对人体健康造成严重损害。开发一种超灵敏、简便、快速的OTA检测方法对食品质量与安全检测尤为重要。本发明构建了一种基于核酸适配体‑Mgsupgt;2+/supgt;依赖性DNA酶的比色传感方法用于OTA的痕量检测。核酸适配体与Mgsupgt;2+/supgt;依赖性DNA酶(MNAzyme)通过分子桥(辅助探针DNA1和DNA2)结合形成稳定的四链体结构，当OTA存在时与核酸适配体结合，释放出MNAzyme单链，从而循环催化裂解修饰有rA位点的发夹底物HP，生成的富G序列在hemin和Ksupgt;+/supgt;存在下形成hemin/G四链体DNA酶，并催化Hsubgt;2/subgt;Osubgt;2/subgt;介导的生色底物显色。结果表明在0.5nM～25nM范围内线性良好，检出限为0.41nM，满足实际检测要求。与传统比色法相比，本发明具有灵敏度更高、操作简单、检测成本低等优点。

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种分子桥介导的赭曲霉毒素 A检测方法及试剂盒。

背景技术

赭曲霉毒素是一类由真菌产生的有毒的次级代谢产物，在粮食谷物中检出率高、污染范围广。其中赭曲霉毒素A(OTA)具有较强的毒性和生物富集作用，食品中低浓度的赭曲霉毒素A能威胁人们的身体健康，造成严重的安全事件。实现赭曲霉毒素A的实时快速检测对于控制食品安全具有重要意义。比色检测法通过溶液颜色改变而建立起来的一种分析方法，它可通过肉眼直接读数结果，不需要借助大型的检测仪器，以及具备操作简便、耗时短、成本低等优点，在现场快速检测中具有广阔的应用前景。目前，影响比色检测法应用的最大障碍是其较低的检测灵敏度，使其难以满足低浓度目标物的检测需求。

提高检测灵敏度对拓展比色检测法在食品安全领域的应用具有重要的意义。核酸扩增作为一种提高检测灵敏度的常用方法，为满足这一要求开辟了途径。核酸扩增辅助的传感器已经广泛用于低浓度的目标物检测，取得了令人满意的灵敏度、特异性和准确性。然而，基于核酸扩增技术的传感方法用于小分子检测通常需要借助特异性识别的核酸适配体(aptamer，Apt)，它是一种经指数富集配体系统进化技术筛选后获得的具有特定序列的寡核苷酸链。同时，核酸扩增技术所用的寡核苷酸链如Mg²⁺离子依赖性DNA酶(Mg²⁺-dependentDNAzyme，MNAzyme)，也是具有特定序列的寡核苷酸链，要把两条具有特定序列的寡核苷酸链结合起来构建传感方法具有一定的挑战。

本发明利用两条寡核苷酸链作为分子桥，将Apt和MNAzyme结合起来，构建了一种基于Apt-MNAzyme的比色传感方法，并成功应用OTA的高灵敏、快速检测。与传统的高效液相色谱法、气相色谱法等相比。该方法不需要昂贵仪器以及专业的技术人员，并具有灵敏度高、准确性好、检测速度快等优点，在食品安全检测、环境监测等领域具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的在于提供一种测定赭曲霉素A的可视化检测方法。为此，基于MNAzyme裂解策略，构建了一种比色传感技术检测OTA。如图1所示， Apt和MNAzyme通过分子桥(探针辅助探针DNA1和辅助探针DNA2)连接在一起形成稳定的四链体复合物。当不存在OTA时，MNAzyme被封闭而失去催化活性，不能对DNA底物HP进行切割产生信号；当存在OTA时，OTA会与 Apt结合释放出MNAzyme，从而在Mg²⁺的参与下催化裂解修饰有rA位点的 DNA底物HP，将其裂解成两个片段，MNAzyme重新结合新的底物HP启动下一轮催化裂解反应，经多轮循环裂解后，释放出大量的富G序列，该序列在hemin 和K⁺存在下形成hemin/G四链体DNA酶，并催化H₂O₂介导的生色底物ABTS 显色，溶液呈绿色。该方法在0.5nM-25nM范围内，OTA的浓度与吸光度之间有良好的线性关系，检出限为0.41nM。大米中OTA的加标回收率在 93.6％-108.6％范围内，说明该方法能较好地识别复杂体系中的OTA。