[发明专利]重组纤连-胶原蛋白高纯度高效率制备方法

说明书

本发明公开了一种基因重组纤连‑胶原蛋白(Fibronectin‑Collagen)的高纯度高效率的纯化方法，包括以下步骤：S1，获取表达融合蛋白Fibronectin‑Collagen的毕赤酵母菌菌液；S2，将毕赤酵母菌菌液离心，菌体沉淀重悬，超声破碎，再离心，得蛋白混合液；S3，将该混业溶液经陶瓷膜过滤后，滤液经柱层析分离得到纯的重组纤连胶原蛋白溶液；S4，重组纤连胶原蛋白溶液经超滤膜浓缩脱水脱色除盐后可得到不同浓度的浓缩液，浓缩液经冷冻干燥可得目标蛋白。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因重组纤连胶原蛋白Fibronectin-Collagen的纯化方法。

背景技术

纤连蛋白(fibronectin，FN)广泛存在于动物界(从淡水海绵到人类)，是一种大的纤维状糖蛋白，含糖量4.5％-9.5％，其亚单位分子质量为220-250kDa，约由2500个氨基酸残基构成。不同组织来源的FN亚单位结构不尽相同，但很相似。其肽链的共同特点是由一些重复的氨基酸序列构成若干球形结构域，每个球形结构域可分别与不同的大分子或细胞表面特异性受体结合，从而使之成为多功能分子。FN在体内的分布十分广泛：以可溶形式存在于血浆及各种体液中；以不溶形式存在于细胞外基质(包括某些基膜)及细胞表面。前者称为血浆FN，后者称为细胞FN。FN主要由间质细胞(如成纤维细胞、成软骨细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等)产生。

胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。

动物组织是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径，但由于相关畜类疾病和某些饮食禁忌限制了人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的使用。

重组胶原蛋白是利用前沿的结构生物学、基因工程等技术，以人特定型别胶原蛋白功能区基因编码为模板，进行筛选、制备得到与人胶原蛋白氨基酸序列相同或类似的一类新型生物材料。其中，与人胶原蛋白全长或部分氨基酸序列一致的重组人源化胶原蛋白，不含非人胶原蛋白的序列片段，其免疫原性风险低。目前，重组人源化胶原蛋白正逐步推广应用于生物医学领域，具有广阔的发展前景。

由于纤连蛋白广泛参与细胞迁移、粘附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子样作用。纤连蛋白作为细胞培养的基质，可提高多种细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强，DNA、RNA及蛋白质合成速度显著提高。以上所述纤连蛋白的优点和胶原蛋白形成了天然的互补性。基于此，将纤连蛋白和胶原蛋白的关键功能片段通过基因编辑手段整合到一个基因序列，并通过毕赤酵母菌进行发酵培育出了特定分子量的重组纤连胶原蛋白Fibronectin-Collagen。

发明内容

为了解决现有技术中发酵液中提取重组纤连胶原蛋白Fibronectin-Collagen收率低，纯度低，操作复杂分离成本高等方面的技术缺陷，本发明经过深入研究，开发出了一套行之有效的简便高效高纯的重组纤连胶原蛋白Fibronectin-Collagen 的纯化方法。

本发明所涉及的纯化方法涉及以下步骤：

S1，获取表达融合蛋白Fibronectin-Collagen的毕赤酵母菌菌液；

S2，将毕赤酵母菌菌液离心，菌体沉淀重悬，超声破碎，再离心，得蛋白混合液；

S3，将该混合液经陶瓷膜过滤后，滤液柱层析分离得到纯的重组纤连胶原蛋白溶液；

S4，重组纤连胶原蛋白溶液经超滤膜浓缩脱水脱色除盐后可得到不同浓度的浓缩液，浓缩液经冷冻干燥可得目标蛋白。

1.根据以上所述的基因重组纤连胶原蛋白(Fibronectin-Collagen)的纯化方法，在步骤S1中，毕赤酵母菌株选自： GS115、X33和KM71，最优选GS115菌株。