[发明专利]一种可筛除假阳性愈伤组织的植物基因编辑重组载体及应用

说明书

本发明公开了一种可筛除假阳性愈伤组织的植物基因编辑重组载体及应用。该重组载体可筛除假阳性愈伤组织及转化株，重组载体中包含NtAN2基因元件，是将一个NtU4M启动子驱动，35S终止的含有NtAN2基因元件的表达框加入到T‑DNA中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体；整个表达框序列为SEQ ID No.1。采用本发明的方案进行植物基因编辑技术创制突变体时，在抗性愈伤组织阶段通过肉眼可辨的红色即可判定愈伤组织是否为转基因假阳性。假阳性愈伤组织的筛除减少了假阳性植株的出现，降低了后期对假阳性植株的栽培、检测等步骤的投入，使有效发生基因编辑植株出现的概率也进一步提高。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种可筛除假阳性愈伤组织的植物基因编辑重组载体及应用。

背景技术

CRISPR/Cas9技术自2012年开发至今，已在基因编辑领域得到广泛应用。其构成包含人工改造的引导RNA(sgRNA)和Cas9核酸酶两个部分。基因编辑原理是在Cas9核酸酶表达框中加入核定位信号(NLS)，Cas9在细胞质中翻译后由核定位信号引导进入细胞核与sgRNA结合，sgRNA中加入20nt序列特异的引导序列，二者形成复合体，识别sgRNA中20nt特异序列互补的DNA位点，切割形成DNA双链断裂。通常情况下DNA的修复以非同源末端连接(NHEJ)方式为主，会形成短片段的Indel(碱基插入或删除)，造成靶基因的移码突变。

在植物基因编辑的实施过程中一般需要组织培养形成抗性愈伤组织，抗性愈伤组织分化形成抗性植株。组织培养过程中会存在假阳性抗性愈伤组织，假阳性抗性愈伤组织会进一步分化成假阳性植株，在大规模突变体创制中假阳性愈伤组织的出现，增加了编辑植株的筛选范围和难度，使得检测成本大幅提升。

目前现有传统的荧光蛋白、GUS、荧光素酶等基因也可以用于假阳性愈伤组织的排除筛选。这些基因的检测要么需要借助昂贵仪器，要么需要特异底物做催化反应，在大规模突变体创制应用中存在很大局限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可筛除假阳性愈伤组织的植物基因编辑重组载体及应用，其克服了现有技术的上述缺陷,解决组培阶段存在假阳性愈伤组织的问题，促进利用基因编辑技术的大规模突变体创制。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种植物基因编辑中的重组载体，所述重组载体可筛除假阳性愈伤组织，所述重组载体中包含NtAN2基因元件，是将一个NtU4M驱动，35S终止的含有NtAN2基因元件的表达框加入到T-DNA中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体；整个表达框序列为SEQID No.1。

优选地，基因元件能行使基因编辑功能，NtAN2基因是来源于烟草的MYB转录因子，用于促进植物花青素的合成。

优选地，UNS表达框能表达产生调控花青素合成的蛋白，导致植物组织中大量积累花青素，产生肉眼可见的红色，使整个愈伤组织呈现红色。

一种可筛除假阳性愈伤组织的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用。

一种可筛除假阳性愈伤组织的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用，包括以下步骤：

(1)NtAN2基因元件及表达框的制备：NtAN2基因由NtU4M启动子驱动，35S终止子终止，整个表达框序列为SEQ ID No.1，并利用上下游各含有骨架载体两端15bp同源序列的引物PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，获得该表达框线性化DNA片段；

(2)重组载体的构建：利用限制性内切酶KasI和HindIII双酶切骨架载体pORE-Cas9，琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化的线性化骨架DNA，将NtAN2表达框线性化DNA与纯化的线性化骨架DNA进行重组反应；将重组产物转化进入大肠杆菌，经筛选、测序获得基因编辑重组载体pORE-Cas9/NtAN2；