[发明专利]一种可筛除假阳性愈伤组织的植物基因编辑重组载体及应用

权利要求书

1.一种可筛除假阳性愈伤组织的重组载体，其特征在于，所述重组载体中包含NtAN2基因元件，是将一个NtU4M启动子驱动，35S终止子终止的表达NtAN2基因的表达框加入到T-DNA中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体；整个表达框序列为SEQ ID No.1。

2.根据权利要求1所述的可筛除假阳性愈伤组织的重组载体，其特征在于，NtAN2基因是来源于烟草的MYB转录因子，用于促进植物花青素的合成。

3.根据权利要求2所述的可筛除假阳性愈伤组织的重组载体，其特征在于，NtAN2基因所在表达框转入植物细胞后能表达产生调控花青素合成的蛋白，导致植物愈伤组织中大量积累红色花青素，肉眼能够区分阳性愈伤组织和假阳性愈伤组织，将假阳性愈伤组织剔除能提升基因编辑素材创制效率。

4.根据权利要求1-3任一所述的可筛除假阳性愈伤组织的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用。

5.根据权利要求4所述的可筛除假阳性愈伤组织的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)NtAN2基因元件及表达框的制备：NtAN2基因由NtU4M启动子驱动，35S终止子终止，整个表达框序列为SEQ ID No.1，并利用上下游各含有骨架载体两端15bp同源序列的引物PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，获得该表达框线性化DNA片段；

(2)重组载体的构建：利用限制性内切酶KasI和HindIII双酶切骨架载体pORE-Cas9，琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化的线性化骨架DNA，将NtAN2表达框线性化DNA与纯化的线性化骨架DNA进行重组反应；将重组产物转化进入大肠杆菌，经筛选、测序获得基因编辑重组载体pORE-Cas9/NtAN2；

(3)基因敲除载体库的构建：根据靶基因的序列特异性设计出23nt特异序列以及上下游引物，PCR退火连接并转化农杆菌；

(4)基因敲除载体库转化植物外植体及抗性愈伤组织获得：利用制备的农杆菌侵染野生型烟草，诱导形成抗性愈伤组织；

(5)抗性愈伤组织的T-DNA标签筛选：提取抗性愈伤组织的基因组DNA，利用NOS终止子的特异引物进行PCR扩增，鉴定T-DNA的存在。