[发明专利]细胞牵引力的测量方法

说明书

本发明提供了一种细胞牵引力的测量方法，其为一种超分辨率TFM方法，所述方法包括：(A)在基底材料表面形成示踪用荧光球体的步骤；(B)细胞外基质蛋白修饰的步骤；(C)图像采集的步骤以及(D)位移场和牵引力场计算的步骤，其中，步骤(A)中，所述基底材料为经由具有伯胺基的不饱和单体共聚改性的聚丙烯酰胺材料；所述示踪荧光球体的平均粒径为90～110nm；步骤(B)中，所述细胞外基质蛋白经由光反应蛋白交联剂与所述示踪荧光球体结合，所述结合引起所述基底材料表面形变；步骤(C)中，包括使用基于结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,SIM显微镜)采集所述荧光球体在所述细胞外基质蛋白作用下的形变图像；步骤(D)中，通过计算机软件程序进行细胞牵引力场的计算。

技术领域

本发明涉及一种用于细胞与周围环境的力学信号观测的技术手段，更具体涉及细胞牵引力的测量方法，即一种细胞牵引力显微镜技术(traction force microscopy，TFM)。

背景技术

生物体的整个生命过程都与周围力学环境密不可分，例如：宇航员长期生活在太空失重环境中，骨组织中破骨细胞被激活导致骨丢失的发生；离子通道蛋白Piezo可以直接感知周围环境的拉压剪切力，改变蛋白结构并激活下游生化信号。

细胞是生物体结构和功能的基本单位。细胞及其内部的分子变形、运动及相互作用等力学行为贯穿了细胞的整个生命过程。随着越来越多的力学刺激调控细胞功能的信号通路的发现，目前学术界已经基本达成共识：力学与生化因素的耦合在细胞的生命过程中具有重要意义。

细胞在胞外基质中的黏附和迁移需要依靠两者之间的动态相互作用力，又称“细胞牵引力”。细胞牵引力由细胞内部应力纤维的相对滑移产生，经由黏着斑(一种位于细胞膜表面、由跨膜蛋白整合素和多种胞浆蛋白构成的蛋白大分子复合物)传递到细胞外基质，是细胞感知和响应胞外环境，行使正常生理功能的必要条件，是细胞最重要的力学特性之一。

细胞牵引力会影响细胞及胞外基质的生化和力学状态。例如：整合素的激活和黏着斑的成熟等生化事件要求牵引力超过一定的阈值；牵引力可以调控胞外基质的蛋白纤维结构和排列方向。

细胞内部应力纤维的相对滑移速度和整合素的活化状态也会影响细胞牵引力的大小。例如：布雷他汀和肌球蛋白轻链酶抑制剂都可以通过抑制肌球蛋白活性降低应力纤维相对滑移速度，减小细胞牵引力。

通常情况下，细胞在组织中倾向于维持牵引力大小的稳定，这对正常生理过程具有重要的意义，而牵引力大小的异常改变将会导致疾病的发生，例如癌症、组织过度纤维化、动脉粥样硬化等。

因此，细胞牵引力与胞内外生化-力学信号是相互耦合且实时改变的。理解这种力-生化耦合互作机制，将对解释胞外环境调控细胞特性的原理、解读细胞感知和响应周围力-生化环境的机制、探究力信号和生命之间的关系有很大帮助。为此，我们需要一些技术方法，在活细胞中对生化信号和力学信号进行长时间的同步动态观测。其中，生化信号的观测可通过将目标蛋白标记上荧光，利用荧光显微镜进行观察；力学信号的观测则依赖于测量细胞牵引力的技术方法。

在细胞力学信号测量的领域，近四十年来，研究者们开发了多种测量细胞牵引力的技术方法，主要分为两大类：通过测量荧光信号强度计算分子变形估算牵引力的荧光分子探针方法、通过测量弹性材料变形估算牵引力的微柱阵列方法和弹性基底膜方法(即“细胞牵引力显微镜技术”)。

荧光分子探针方法：

荧光分子探针方法基于荧光共振能量转移原理而实现：对于两个不同的距离很近的荧光分子，若其中一个荧光分子(称为“荧光供体”)的发射光与另一个荧光分子(称为“荧光受体”)的激发光重叠，则供体在被外界光照射激发后，其发射能量会通过共振转移给受体，激发受体发射荧光，供体发射荧光的强度相应减弱。共振能量转移的程度与荧光供、受体分子间距相关，当间距小于10纳米时即可发生能量转移，间距越小能量转移程度越高。