[发明专利]一种利用微生物转化花色苷的方法

权利要求书

1.一种利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：步骤如下：

S1、蓝莓前处理：取无损伤无腐烂的新鲜的蓝莓，进行多次清洗，清洗完成后进行保鲜操作，冷冻保藏一段时间后，利用破壁机粉碎后过筛处理得到蓝莓的果渣；

S2、花色苷的粗提物的制备；利用丙酮：水：柠檬酸：作为萃取剂，将300g的蓝莓果渣放入到2L的萃取剂中进行研磨，进行低温萃取，温度为40-45℃，时间为60min；得到的浆液进行超声处理，处理时间30分钟，超声次数为3次，控制温度为30℃，每次的超声间隔为10分钟，将超声处理后的悬浮液进行离心处理，得到的沉淀物依次进行抽滤、旋转蒸发操作得到粗提物，将上述粗提物溶于体积比为1:1的乙醇和水的混合溶液中；

S3、花色苷的提纯：将步骤2制备的花色苷的粗提物利用柱色谱进行分离，利用丙酮进行梯度洗脱，每次洗脱用1L的丙酮，洗脱两次，得到花色苷洗脱液，所述花色苷洗脱液在40℃下进行旋转蒸发，得到干燥的花色苷提取物；

S4、使用 MRS 培养基活化和扩培大肠杆菌；并将大肠杆菌的活化菌液接种至MRS液体培养基，在37℃下培养48小时，每4小时进行一次摇匀；培养完成后，转移微生物培养液至无菌离心管中，离心后倒去上清液，得沉淀，用蒸馏水洗涤1次，得到微生物菌体；

S5、将步骤S3花色苷提取物5g加入到10ml纯净水中，用0.23um微孔滤膜过滤除菌，将得到过滤除菌的花色苷提取物中加入磷酸钾缓冲液中；

S6、将步骤S4的微生物菌体25g加入到步骤（5）中的花色苷提取物的缓冲液中，将上述溶液置于35～37℃静置发酵；

S7、发酵结束后，在步骤S6中的菌悬液中加入细胞通透剂，10分钟后，对菌悬液进行超声处理30分钟，促进菌体破裂释放内容物，然后离心10分钟，分离菌体，得到的上清液，然后分别利用2倍体积的正己烷萃取和2倍体积的乙酸乙酯萃取，获得转化产物。

2.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S1的具体操作如下：取无损伤无腐烂的新鲜的蓝莓，进行多次清洗，清洗完成后晾干水分，然后将蓝莓放入26-30℃进行热保存半小时，然后将热处理后的蓝莓放入到冷冻室内，采用降温速率为0.5℃/h逐步降温的方式，降温到5-7℃时，停止降温；保持在3-4℃，冷藏10小时，将冷藏后的蓝莓放置到保鲜液中，浸泡时间为 3-5min，完成浸泡后将蓝莓取出后晾干；将晾干的蓝莓放入保鲜箱内，再将保鲜箱放入到冷冻室进行冷藏，初始时，冷冻室的温度为1-2℃，存贮0.5 h后，再使冷冻室的温度降为-2-5℃，存贮2h后，利用破壁机粉碎后过筛处理得到蓝莓的果渣。

3.根据权利要求2所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述保鲜液按照重量份数包括以下组分：葡萄籽35份、壳聚糖25份、蒸馏水500份，制备方法为：将葡萄籽放入容器内，加入上述份数的蒸馏水进行煎煮，加热后并保持沸腾10min，然后冷却到室温后过滤后得到过滤液，再向过滤液内添加上述份数的壳聚糖即得到保鲜液。

4.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S2中的丙酮、水、柠檬酸的体积比为70：25：5。

5.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S5中磷酸钾缓冲液的浓度为7.0-7.5g/L。

6.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S7中所述细胞通透剂为吐温-60，所述吐温-60的加入量为6.5-10.5g/L。

7.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：大肠杆菌的活化菌液接种至MRS液体培养基的接种量为1.5%。

8.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：

所述步骤S4中的使用MRS 培养基活化和扩培大肠杆菌的操作如下：将大肠杆菌的菌粉溶于无菌水，稀释一定倍数后接种于 MRS 固体培养基，封口，在37℃下培养 48 h，挑选形态良好的单菌落进行平板划线，传代培养三代，全程无菌操作，避免污染。