[发明专利]一种同时检测大熊猫12个基因座的复合扩增试剂盒及其使用方法和应用

说明书

本发明涉及DNA检测鉴定技术领域，尤其涉及一种同时检测大熊猫12个基因座的复合扩增试剂盒及其使用方法和应用。一种同时检测大熊猫12个基因座的复合扩增试剂盒，所述12个基因座分别为：gpz‑054、GPL‑047、gpz‑020、SRY、gpz‑006、GPL‑031、GPL‑029、GPL‑053、gpz‑051、ZF、gpz‑047和GPL‑060；所述的12个基因座对应的引物序列如SEQIDNO：1～24所示。本发明试剂盒的荧光复合扩增系统的灵敏度高，在DNA模板量为0.1ng的条件下，可检出全部12个基因座，可以快速实现对于大熊猫的个体识别、性别鉴定和亲子鉴定。

技术领域

本发明涉及DNA检测鉴定技术领域，尤其涉及一种同时检测大熊猫12个基因座的复合扩增试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

大熊猫深受气候变化和人类活动的影响，现在大熊猫仅斑块状的分布于青藏高原边缘6片孤立的高山峡谷中。大熊猫生性警惕，很难直接观察。近代分子生物学的快速发展，使大熊猫的生态学研究工作取得了突破性进展，特别是微卫星标记和非损伤性遗传取样技术的联合使用，可以在不干扰、不伤害的前提下开展大熊猫群体水平的研究，在过去的20年为大熊猫的保护研究工作作出了巨大贡献。

微卫星标记，也称短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)，是由长度为3～7个碱基对的短串联重复序列组成。这些重复序列广泛的存在于大熊猫基因组中。由于具有高度多态性和稳定性、遵循孟德尔遗传规律、共显性遗传等优点且STR基因分型方法所扩增的产物长度较短，因此对于模板质量要求较低，即使降解的DNA模板也可以进行分析。现在STR基因座已经广泛应用于大熊猫亲子鉴定、种群数量调查、遗传多样性评估、种群遗传结构分析、种群遗传管理等诸多领域。

目前应用的大熊猫STR基因座，多为二碱基重复基因座，在PCR扩增过程中，由于链滑脱现象容易产生结巴带(stutter)导致分型错误。四碱基重复STR基因座的stutter产物远少于二碱基重复STR基因座，且更易于电泳分型，因此四碱基重复STR基因座是目前人类法医学中应用最普遍的遗传标记，如美国CODIS(Combined DNA Index System)国家DNA数据库所选用的13个核心STR基因座均为四碱基重复。因此，未来在大熊猫研究中应该加大对稳定性更强的四碱基重复STR标记的使用和推广。

大熊猫雌雄个体外貌无明显差别，成年大熊猫可通过生殖器外观判断性别。但是大熊猫新生幼崽的生殖器官很不明显，即使经验丰富的饲养人员也会偶尔判断失误，有时需要DNA水平的性别鉴定。大熊猫中通常用sex determining region Y(SRY)和Zinc-finger protein gene(ZF)指示性别。SRY位于Y染色体上，雄性大熊猫有一条带，雌性大熊猫没有条带。ZF基因在X、Y染色体上，并且选取目标区域的ZF-X比ZF-Y条带短7bp，可以通过扩增出峰来判定性别，单峰为雌性，双峰为雄性。目前，在大熊猫STR检测应用中，常染色体分型和性别染色体检测是分开的，如果能同时检测常染色体STR基因座和性别染色体基因座，可以减少工作量，提升检验效率。

因此，如何提供一种能同时用于大熊猫常染色体分型和性别染色体基因座的试剂盒，以解决现有技术当中缺少相关检测方法的技术问题，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测大熊猫12个基因座的复合扩增试剂盒及其使用方法和应用，具体是涉及一种同时分析大熊猫10个常染色体基因座和2个性别染色体基因座的五色荧光标记复合扩增试剂盒，包含等位基因分型标准物，可以准确地进行STR分型，该试剂盒可以应用于个体识别、性别鉴定和亲子鉴定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：