[发明专利]一种制备双链RNA的方法

说明书

本发明属于核酸技术领域，为解决现有方法中RNA与转录模板过多结合导致聚合酶的聚合反应受阻、核糖核酸酶H与转录模板的结合影响聚合酶延伸速率的问题，本发明提供一种制备双链RNA的方法。首先，针对要制备的双链RNA，设计含有错配且序列完全对称的泡状结构的环状双链DNA模板；然后设计短链DNA作为辅助链；接着，在体系中同时加入环状双链DNA模板、RNA聚合酶、RNase H、辅助链、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶进行转录。转录出的RNA与泡状结构处的单链DNA结合非常弱，降低了对RNA聚合酶的聚合反应的阻碍；RNase H的酶切位点不在环状双链DNA模板的泡状结构处，避免了对聚合酶延伸的影响。

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链RNA的方法。

背景技术

用酶法合成双链RNA(dsRNA)时，既可以用线性转录，也可以用滚环转录(按照模板为线性还是环状来划分)。线性转录时，要么是用两种双链DNA模板分别转录出sense链和antisense链再退火杂交(Nucleic Acids Res,2003,31,e38.)；要么是用含回文序列的线性双链DNA模板制备得到同时含有sense链和antisense链的发卡型RNA，由Dicer酶进一步加工处理得到最终的siRNA单体(Mol Biotechnol,2017,59,73-83.)。相较线性转录而言，滚环转录的效率有了很大提升。跟线性转录类似，现有做法要么是用一种环状单链DNA模板来同时满足sense链和antisense链的生产(Oligonucleotides,2006,16,353-363；NanoLett,2018,18,4279-4284.)；要么就是用两种环状单链DNA模板分别转录出sense链和antisense链，再经退火杂交得到目的dsRNA(Sci Rep,2017,7,10005；Adv Sci(Weinh),2017,4,1600523.)。

上述酶法制备方法中所用到的模板里几乎都有启动子序列，且为了高效转录，启动子编码链下游的最初两个碱基须为GG，若想得到精确产物，后续需去除(Nucleic AcidsRes,2003,31,e38.)。用一种模板实现sense链和antisense链同时制备的方法会引入较多多余序列。用两种模板分别制备出sense链和antisense链的方法一方面较繁琐；另一方面，因聚合酶本身有较强的序列和结构偏好性(Nucl Acids Res,2014,42,10596-10604；Science Advance Today,2015,25226.)，很难保证sense链和antisense链被等量生产出来，这样dsRNA产物中常混杂有单链RNA(ssRNA)副产物，其会引起免疫反应，在后期的产物纯化过程中需去除。并且滚环转录产生的串联重复产物仅是“半成品”，需进行“截断”处理才能得到最终的产物单体，但尚未开发出高效的产物截断方法，因此该方法尚不能实现dsRNA的大量、高效合成。

申请号为CN202111557772.1的专利公开了一种制备双链RNA的方法，该方法中采用的环状双链DNA模板含有不互补的泡状结构部分和互补部分，不含启动子序列，所述互补部分与要制备的双链RNA长度相同且序列相同，序列中T对应U，所述泡状结构处于环状双链DNA模板中互补部分的两端，泡状结构的长度为5-15bp，泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个；该方法是将环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，在转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处单链DNA的辅助下及时实现对含有重复序列的转录产物的酶切，获得满足要求的目的双链RNA单体。使用该方法时，由于转录出的RNA会和泡状结构处的单链DNA部分结合，这会导致RNA聚合酶的聚合反应受阻；并且核糖核酸酶H在泡状结构处单链DNA的辅助下对转录产物进行截断时，核糖核酸酶H的结合会影响聚合酶的延伸速率。上述两方面因素共同作用使得整体的双链RNA制备效率较低，换言之，该方法的效率还有很大的提升空间。

发明内容