[发明专利]一种制备双链RNA的方法

权利要求书

1.一种制备双链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，设计、制备并纯化环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板由对称泡状结构部分和完全互补部分组成，所述对称泡状结构部分是一段含有部分错配碱基对的回文序列，作为转录起始部分，所述对称泡状结构长度为10-30bp；所述完全互补部分与要制备的双链RNA的长度和序列均相同，序列中T对应U，所述对称泡状结构的两端同完全互补部分的两端分别相连形成环状双链DNA模板，所述双链DNA模板的两条链分别为模板链1和模板链2；

步骤二，设计并制备Aid-DNA，所述Aid-DNA为单链DNA，其可互补结合所述模板链1和模板链2在对称泡状结构处的转录产物，以形成核糖核酸酶H的作用区域，从而同时实现核糖核酸酶H对模板链1和模板链2转录产物的高效截断，所述模板链1和模板链2杂交后含有完全互补部分和错配的泡状结构，所述Aid-DNA的长度为6-30nt；

步骤三，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的双向滚环转录，核糖核酸酶H则在Aid-DNA的辅助下对含有重复序列的转录产物进行截断，同时获得模板链1和模板链2的转录产物单体；这两种互补的RNA转录产物单体在反应体系中自发、快速杂交，最终获得目的双链RNA。

2.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为50-1000bp。

3.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为59-109bp。

4.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于70bp时，采用一段法设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；

当所述环状双链DNA模板长度大于70bp时，采用一锅法或分段法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；

所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离泡状结构的边缘大于10nt。

5.根据权利要求4所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板过程中，退火杂交条件为：先在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min。

6.根据权利要求4所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板过程中，当使用T4 DNA连接酶和相应的T4 DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃温度范围内保温2-24h进行连接；当使用Taq DNA连接酶和相应的Taq DNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。

7.根据权利要求6所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当使用T4 DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl,10mMMgCl₂,10mM DTT,500μM ATP，pH 7.8@25℃；当使用Taq DNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl,25mM KAc,10mM Mg(Ac)₂,10mM DTT,1.0mM NAD,0.1％Triton X-100，pH 7.6@25℃。

8.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链环状DNA模板的纯化是指用核酸外切酶酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA。