[发明专利]一种制备单链RNA的方法

说明书

本发明属于核酸生物技术领域，为解决现有单链RNA制备方法难以实现工业化生产的问题，提供了一种制备单链RNA的方法。针对目的单链RNA，先设计一个含有错配的、不对称性强的错配序列区域的无启动子环状双链DNA模板，其中一条链为模板链，转录出的RNA包含目的单链RNA；设计并制备辅助链Aid‑DNA，其序列同该错配序列区域处模板链转录出的RNA产物的序列互补。该错配序列区域处错配碱基的存在使得聚合酶从此处顺利、高效起始转录；错配序列区域的不对称性使得聚合酶仅偏好转录一条链；核糖核酸酶H在Aid‑DNA的辅助下可高效截断串联重复转录产物，实现了目的产物的一步、高效、大量制备。

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备单链RNA的方法。

背景技术

随着人们对RNA研究的不断深入，RNA的一些功能不断被揭示，在医药、食品、纳米材料等领域都显示出极好的发展前景，亟需充足的RNA来满足科研需求和市场需求。但是目前RNA的大量合成还未实现，导致RNA的价格十分昂贵，在很大程度上限制了RNA的研究和应用。

RNA制备方法可分为体外合成和体内合成(重组过表达)两大类，体外合成又可分为化学法合成和酶法合成两大类(Analytical and bioanalytical chemistry,2018,410,3239-3252.)。目前用于体内制备RNA的宿主主要为大肠杆菌(E.coli)，以其作为宿主时生产周期短、产率高。也有利用亲硫菌(R.sulfidophilum)作为宿主的，产物被蛋白污染的程度较低，易纯化。但上述生物制备方法存在诸多问题，如产物易被胞内的RNA酶降解，缺少用于产物亲和纯化的有效tags，并且质粒载体的构建、转染、细胞培养、裂解、产物提取纯化等诸多步骤使得该方法在实际应用时较为繁琐(Analytical and bioanalyticalchemistry,2018,410,3239-3252.)。化学合成法(固相合成)目前应用良好，特别适用于小分子RNA(如小于25nt)药物，但存在产量低、合成步骤繁琐(有机化学,1994,14,17；Naturestructural biology,1998,5,203-212；Israel Journal of Chemistry,2013,53,326-349.)、纯度差(Analytical biochemistry,2001,298,196-206.)、无法合成长链RNA(CHIMIA International Journal for Chemistry,2005,59,812-816.)、产品安全性差(使用多种有机试剂)(化学试剂,2000,22,5.)等问题。为了提高化学合成的产率，有研究人员在液相合成方面做了初步探索，但产率仍不尽如人意(陆威,核酸的化学合成研究以及4′-C-羟甲基修饰siRNA的合成及干扰活性测试,华中师范大学硕士学位论文,2014.)。酶法(转录法)是在RNA聚合酶体外转录的基础上发展起来的，相较化学合成而言，这种方法因在液相环境中进行而易于实现大规模生产。酶法可满足较长RNA的合成，并且整个过程中没有涉及到有害有机试剂，因此产品的安全性更高，对环境也更加友好(Israel Journal ofChemistry,2013,53,326-349；CHIMIA International Journal for Chemistry,2005,59,812-816.)。近些年的研究还表明该方法可满足带修饰RNA的合成，具有良好的应用前景(Organicbiomolecular chemistry,2018,16,5800-5807；Molecules,2020,25,5492.)。