[发明专利]一种制备单链RNA的方法

权利要求书

1.一种制备单链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板中不含启动子序列，由错配序列区域和完全互补序列区域两部分以首尾相连构成，所述错配序列区域为含有错配碱基的一段序列，其长度为5-20bp；错配序列区域和/或完全互补序列区域含有不对称序列，不对称分三种情况：①序列本身不对称；②只在非模板链上引入修饰基团；③模板链和非模板链的长度不同，所设计模板须满足至少一种情况；错配序列区域的错配碱基对数占20-100％；将所述环状双链DNA模板中的一条DNA链作为模板链，该模板链转录出的RNA产物含有目的单链RNA的序列；

步骤二，设计并制备Aid-DNA，所述Aid-DNA为长度6-20nt的单链DNA，所述Aid-DNA可互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA-RNA双链部分，所述特定部位是指由所述模板链的错配序列区域处转录出的RNA部分；

步骤三，纯化所制备的环状双链DNA模板，以去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；

步骤四，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录和RNase H酶切，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行单向滚环转录，Aid-DNA互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA-RNA双链部分，核糖核酸酶H水解与Aid-DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，从而将含有重复序列的RNA产物进行截断，获得目的单链RNA。

2.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述目的单链RNA的长度为50-2000nt。

3.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述错配序列区域的碱基错配数占比为25-60％。

4.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述错配序列区域的不对称性为25-100％，所述不对称性为非回文序列长度与错配序列区域总长的比值。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于等于70bp时，采用一段法设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；

当所述环状双链DNA模板长度大于70bp时，采用分段法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；

所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离错配序列区域的边缘大于10nt。

6.根据权利要求5所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板的过程中，退火杂交条件为：先在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min。

7.根据权利要求5所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板的过程中，当使用T4 DNA连接酶和相应的T4 DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃温度范围内保温2-24h进行连接；当使用Taq DNA连接酶和相应的Taq DNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。